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1. ESTUDIO Y DESARROLLO DE FILMS BIODEGRADABLES PARA ENVASADO DE ALIMENTOS FRESCOS O MÍNIMAMENTE PROCESADOS Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa ET1 BIOFRE MODALIDAD 1. PROYECTOS I+D INDEPENDIENTE Num. Expediente: 2019.08.CT01.0035 p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 1 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

34. • Recepción de la materia prima. En un almacén mayorista de la zona se adquieren plátanos origen canarias, tomate variedad Daniela, manzanas variedad Golden y lechugas variedad iceberg y romana. Se procesan el mismo día que se recepcionan. • Acondicionamiento: Dependiendo del alimento a envasar reciben un tratamiento distinto. - Tomates, se envasan directamente en las distintas bolsas de film, 2 unidades por bolsa. - Manzanas, se lavan, se cortan por la mitad y caen en un baño de ácido ascórbico de concentración 5 g/L para evitar su oxidación. Cuatro trozos son envasados por bolsa. Los resultados iniciales muestran una vida útil muy corta para las manzanas troceadas por lo que se decide realizar otro ensayo en el que las manzanas se envasan enteras. - Plátanos, se envasan directamente en las distintas bolsas de film, 2 unidades por bolsa. - Lechugas, En el caso de las lechugas iceberg se cortan por la mitad y se envasan en las distintas bolsas. La lechuga romana se envasa directamente, una unidad por bolsa. • Envasado al vacío. Los productos objetos de estudio son envasados en los distintos tipos de bolsas en una maquina termoselladora de bolsas, modelo Sammic (Barcelona), con capacidad para termosellar bolsas de 20 litros de capacidad, permite el envasado a vacio ó envasado en atmosfera modificada. Las condiciones de envasado fueron para todos los alimentos y todos los tipos de bolsa fueron con un vacío del 60 % y un tiempo y temperatura conforme a las especificaciones de los materiales del film, antes descritos. En la tabla 1 se muestran imágenes de las distintas muestras objeto de estudio. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 33 ET1BIOFRE p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 3 4 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

35. • Tabla 8: Envasado de frutas y vegetales en muestras de films F0, F4, F5, F6 F8 y F9 día 0 Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 34 ET1BIOFRE p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 3 5 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

2. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 01 ET1BIOFRE Este Proyecto/Programa está financiado hasta el 80% con recursos del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) asignados al Instituto de Fomento de la Región de Murcia con arreglo a la Subvención Global mediante la Decisión C(2015)3408, de la Comisión, por la que se aprueba el Programa Operativo de intervención comunitaria FEDER 2014_2020 en el marco del objetivo de inversión en crecimiento y empleo, en la Comunidad Autónoma de Murcia, como Región calificada en transición. Para cualquier información adicional relativa a este Proyecto/Programa puede dirigirse a: Asociación Empresarial de Investigación Centro Tecnológico Nacional de la Conserva Calle Concordia s/n 30500 Molina de Segura (Murcia) Tel: 968389011 [email protected] p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 2 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

4. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 03 ET1BIOFRE 1. INTRODUCCIÓN En los últimos años, para satisfacer nuevas demandas de los consumidores, ha experimentado un gran desarrollo comercial una nueva gama de productos vegetales vivos, acondicionados para su consumo íntegro y directo, elaborados con técnicas sostenibles y métodos físicos, lavados, desinfectados, mantenidos refrigerados y, generalmente, envasados en atmósfera modificada (EAM) en una película plástica, con las propiedades sensoriales y nutritivas del producto original, y con calidad y seguridad garantizada. Las frutas y verduras mínimamente procesadas en fresco o de la IV Gama experimentan el mayor crecimiento de la industria alimentaria mundial por atender esta demanda y los nuevos hábitos de compra a un costo razonable. El presente y el futuro de estos productos está lleno de oportunidades. En este sentido, las empresas están desarrollando nuevas gamas, formatos, envases, categorías, etc. Para su envasado, tradicionalmente, se utilizan films poliméricos (polietileno, polipropileno) debido a su gran disponibilidad a un coste relativamente bajo con un buen rendimiento mecánico y una buena barrera al oxígeno y al dióxido de carbono 1 . Sin embargo, el uso extensivo de films sintéticos ha dado lugar a graves problemas medioambientales debido a su baja tasa de biodegradabilidad. Según la Comisión Europea, los residuos plásticos, repr esentan más del 80% del total de los residuos marinos, lo que afecta a los ecosistemas, la biodiversidad y, potencialmente, la salud humana, y genera una preocupación generalizada. Muchos envases no se pueden reciclar ya que están formados por diferentes materiales 2 en una misma estructura difíciles de separar. Todo ello ha originado que, fruto de las presiones del consumidor, exista una necesidad creciente en el sector del envase y embalaje de reemplazar los films de envasado fabricados con productos petroquímicos por materiales biodegradables. Muchos esfuerzos se han centrado en el estudio de films biodegradables de altas prestaciones para envasado 1 Siracusa, V., Rocculi, P., Romani, S., & Dalla Rosa, M. (2008). Biodegradable polymers for food packaging: a review. Trends i n Food Science & Technology, 19(12), 634-643. 2 Los envases complejos multicapa presentan distintos materiales en una misma estructura: diferentes polímeros, metales o adhes ivos. p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 4 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

7. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 06 ET1BIOFRE En el paquete de trabajo-PT2, conforme CETEC fué obteniendo films monocapa en la tarea 2.1, CTC fue caracterizando su comportamiento como envase de los alimentos seleccionados. Fruto de las distintas caracterizaciones en la tarea 2.2 se seleccionaron y prepararon los films multicapa que fueron utilizados para envasar y caracterizar la calidad y durabilidad de los alimentos por el CTC, en el paquete de trabajo-PT3. Por último, el análisis de los resultados nos llevó, en el paquete de trabajo-PT4, a una optimización de los parámetros relevantes de los films multicapa atendiendo no solo a criterios de calidad sino también de precio. A continuación, se muestra la distribución en el tiempo de cada una de las tareas realizadas en el proyecto. Todas las tareas se han desarrollado de acuerdo al cronograma previsto al inicio del proyecto sin ningún tipo de desviación. p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 7 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

8. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 07 ET1BIOFRE 4. ANTECEDENTES 4.1. FRUTAS Y HORTALIZAS FRESCAS Y DE IV GAMA. En los últimos años, el establecimiento de nuevos estilos de vida, caracterizados por la falta de tiempo en los preparativos domésticos, se ha visto acompañado por una evolución de la estructura del consumo de alimentos y una desestructuración de las comidas. Por lo tanto, el consumo de frutas y verduras frescas y aquellas mínimamente procesadas ha crecido rápidamente como resultado de las nuevas tendencias de consumo. Una de las formas de conservación más respetuosa con las cualidades organolépticas y nutricionales de los alimentos, es la que se denomina como “IV Gama” (frutas y hortalizas mínimamente procesadas). Esencialmente, consiste en la aplicación combinada de la refrigeración y la modificación de la atmósfera que rodea al alimento. La refrigeración, ralentiza las reacciones de alteración químicas y bioquímicas, limitando a su vez la proliferación de microorganismos serófilos (Singh y col., 2006); mientras que la modificación de la atmósfera, disminuye la tasa respiratoria del vegetal evitando su marchitamiento prematuro, controlando de este modo el pardeamiento al disminuir la presión parcial del oxígeno (Day, 1995; Corbo y col., 2006). Actualmente los alimentos de IV Gama, en especial las frutas y hortalizas, están ampliamente distribuidos en el mercado (Kader y col., 2002). Industrialmente los alimentos en IV gama se desarrollaron hacia 1975 en EEUU para los restaurantes de comida rápida y los llamados “bares de ensaladas” con lechuga Iceberg como producto básico En Europa empezaron en Alemania, por las Olimpiadas de 1972, pero a escala industrial hacia los primeros años 1980, en Alemania y Suiza, continuando hacia 1985 en Inglaterra, Francia, Italia y Países Bajos. En España, esta innovación alimentaria no se inició hasta casi finales de esa última década y su expansión fue y es aún menor que en los países de la UE más avanzados, aunque experimentó un crecimiento sostenido en torno al 15-20% anual acumulativo hasta 2007, con excelentes perspectivas actuales. Incluso durante la reciente crisis económica ha continuado creciendo más del 5% anual, siendo el subsector agroalimentario que muestra una tendencia más favorable a crecer. La demanda fundamental tiene lugar en los comedores de instituciones y empresas y en las cadenas de establecimientos de comidas preparadas; en menor medida los demandan los restaurantes y el consumo doméstico. Su distribución se ha extendido progresivamente a grandes y medianas superficies, supermercados y a comercios de alimentación incluso no especializados. p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 8 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

9. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 08 ET1BIOFRE Las tecnologías tradicionalmente empleadas en la conservación de hortalizas listas para usar son la refrigeración (como requisito indispensable tanto en las etapas de producción, como de distribución, almacenamiento y comercialización) y el envasado en atmósfera modificada (AM). El empleo de atmósfera modificada (AM) en la conservación de alimentos no es un concepto nuevo. La acción del CO2 como conservante es conocida desde principios del siglo XX (Brown, 1998). La comercialización de alimentos conservados en atmósfera modificada, a nivel minorista, apareció en Europa en la década de 1970. Las bondades asociadas a este novedoso sistema de conservación, hizo que creciera enormemente la comercialización de este tipo de productos. En España, los productos conservados en AM se popularizaron con posterioridad, debido a las especiales estructuras comerciales y el fácil acceso de los consumidores a los productos frescos. Básicamente, existen dos formas de aplicar la AM: envasado al vacío o bajo gas. El envasado al vacío no es adecuado para vegetales frescos, ya que en ausencia de oxígeno los vegetales derivan su metabolismo hacia la fermentación, provocando una alteración rápida (González y col., 2008). Cuando se envasa bajo gas, la atmósfera puede obtenerse reemplazando el aire con un gas o mezcla de gases, o bien generando la atmósfera dentro del propio envase de forma pasiva (la más utilizada para vegetales) o activa (empleando absorbedores de oxígeno). La sustitución del aire puede hacerse por arrastre con gas, el cual se inyecta de forma continua y va diluyendo la atmósfera inicial, o bien por vacío compensado. En este segundo proceso, en primer lugar, se aplica el vacío para eliminar el aire del interior del envase y a continuación se introduce el gas o mezcla de gases deseados. En el primer caso, el film del envase es selectivamente permeable al O2 y CO2 y la propia respiración del vegetal modifica la atmósfera. En la generación activa de la AM, se utilizan absorbedores de O2 y etileno o emisores de CO2 y sustancias antimicrobianas (Suppakul y col., 2003; Tefera, y col., 2007). En el envasado se emplean básicamente tres tipos de gases: N2, O2 y CO2, que se combinan en distinta proporción a fin de obtener una atmósfera inerte (N2), semi-activa (CO2/N2, O2/CO2/N2) o activa (CO2, CO2/O2) (Deepak y col., 2007). El tipo de atmósfera y la proporción concreta de cada uno de los gases varía según el tipo de producto a conservar. En el caso de productos vegetales, influyen factores tales como la intensidad respiratoria y/o fotosintética durante la post-recolección, emisión de etileno y facilidad de pardeamiento. No existe demasiada bibliografía al respecto, ya que los estudios sobre el tema tienen una aplicación tecnológica muy directa, y se suelen amparar bajo cláusulas de confidencialidad o la patente correspondiente. No obstante, si son conocidas algunas pautas generales sobre el proceso de conservación (Kader y col., 1989; Parry, 1995; Artés y Artés, 2000), de forma que puede hablarse de productos que soportan porcentajes de CO2 de hasta un 2%. p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 9 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

10. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 09 ET1BIOFRE Se utilizan preferentemente materiales plásticos, que presentan diversas permeabilidades a los gases y permiten mantener la atmósfera interior dentro de unos límites deseados. Las hortalizas mínimamente procesadas que se encuentran en la actualidad en los comercios son productos tales como zanahoria o remolacha ralladas, lechuga, repollo, pimiento, apio o zapallo trozados, hojas de acelga o espinaca enteras o cortadas, inflorescencias de brócoli o coliflor, mezclas de hortalizas de hojas para ensaladas, trozos de verduras para preparar sopas, papas en bastones o rejillas, champiñones fileteados, brotes de soja o alfalfa, etc. Una vez lavados, procesados y desinfectados son envasados en bolsas o en bandejas cubiertas con películas plásticas. El daño mecánico ocasionado los convierte en productos altamente perecederos. A ello se suma en muchos casos el estrés oxidativo asociado a agentes desinfectantes tales como el hipoclorito de sodio. Pero a pesar de las dificultades inherentes a su manejo, son muchas las ventajas que reúnen: -Menor tiempo de preparación de las comidas. -Calidad uniforme y constante de los productos durante todo el año. -Se trata de productos frescos, saludables, ricos en nutrientes. -Facilidad de almacenamiento, ya que al ser porciones requieren menos espacio. -Mayor aprovechamiento, reduciendo el descarte. -Posibilidad de inspeccionar la calidad del producto en la recepción y antes del uso. (Gorrettay col, 2003). Se hace alusión a sólo dos atributos de calidad que influyen en la decisión de los consumidores: la textura y el color. Las variaciones texturales dependerán de los productos que se consideren. En el caso de tejidos en crecimiento, con alta proporción de células meristemáticas y parenquimáticas, los principales cambios texturales incluyen incrementos en la dureza y fibrosidad, asociados con la continuación del crecimiento, la maduración y con la lignificación de los tejidos vasculares. El atributo color es particularmente importante en vegetales verdes donde la clorofila constituye el pigmento predominante. Se trata de un compuesto muy lábil, susceptible a la degradación ocasionada por la luz, la temperatura y la presencia de ácidos, entre otros factores. Una manera práctica y sencilla de analizar la evolución del color en hortalizas es empleando un colorímetro de superficie. Existen otros fenómenos observados en productos mínimamente procesados que revisten importancia desde el punto de vista de su calidad, entre ellos la deshidratación, el desarrollo de apariencia blanco-translúcida en los sectores de corte, la producción de olores extraños, la manifestación de fenómenos de pardeamiento, la liberación de exudado y la condensación de agua dentro de los envases (costa, l., civello, p., martínez, g., chaves, a. 2002). p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 1 0 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

18. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 17 ET1BIOFRE de la cera de abejas. La permeabilidad al vapor de agua disminuyó de 7.78 a 6.56 g mm m -2 h -1 kPa -1 con una concentración de cera de abejas de 0 a 40% (p/p de almidón de guisante) 19 . El quitosano es un polisacárido lineal producido comercialmente por desacetilación alcalina de quitina. Generalmente es un copolímero compuesto de D-glucosamina junto con N-acetil-D-glucosamina 20 . La naturaleza catiónica única que posee el quitosano en relación con otros polisacáridos neutros o con carga negativa le permite impartir propiedades antimicrobianas fuertes y de amplio espectro 21 . Se han propuesto varios modelos para la actividad antimicrobiana del quitosano, pero el más aceptable es la interacción electrostática entre los grupos amino cargados positivamente (NH3+) a valores de pH inferiores a 6,3 (el pKa del quitosano) y la superficie de las bacterias con carga negativa. Esta interacción electrostática produce una interferencia doble: (i) al alterar la permeabilidad de la pared de la membrana, lo que agrava los desequilibrios osmóticos internos y, por lo tanto, evita la propagación de microorganismos, y (ii) por la hidrólisis de los peptidoglicanos en la pared celular de los microbios, lo que lleva a filtración de electrolitos intracelulares, por ejemplo, iones de potasio y otras fracciones proteicas de bajo peso molecular que incluyen proteínas, ácidos nucleicos, glucosa y lactato deshidrogenasa 22 . Los films y recubrimientos a base de quitosano tienen excelentes propiedades mecánicas y permeabilidad selectiva de dióxido de carbono y gases de oxígeno. Sin embargo, la alta permeabilidad al vapor de agua de estos films limita sus aplicaciones 23 . Mezclas de quitosano junto con otros biopolímeros se han estudiado para intentar superar las pobres propiedades barrera. Los compuestos a base de almidón de maíz/quitosano han demostrado una mayor elasticidad ymenor permeabilidad al vapor de agua en comparación con los films fabricados con cualquiera de los biopolímeros por separado 24 . En concreto, las suspensiones formadoras de films de quitosano/almidón y la solución de quitosano demostraron un comportamiento pseudoplástico. La permeabilidad al vapor de agua de la película de almidón fue de 13.2 a 21.2 x 10 -11 , para la película de quitosano fue de 4.5 x 10 -11 g m -1 s -1 Pa -1 , y para el film de quitosano/almidón fue de 3.8-4.5 x 10 -11 g m - 1 s -1 Pa -1 . La mejora observada en las propiedades de barrera se debió a las interacciones entre los grupos hidroxilo del almidón y los grupos amino del quitosano. La presencia de almidón hace que el film compuesto sea soluble en agua y sellable, por lo que es más fácil envolver los productos alimenticios, mientras que la 19 Han JH, Seo GH, Park IM (2006) Physical and mechanical properties of pea starch edible films containing beeswax emulsions. J Food Sci 71(6):E290-E296 20 Dutta PK, Tripathi S, Mehrotra GK, Dutta J (2009) Perspectives for chitosan based antimicrobial films in food applications. Food Chem 114(4):1173-1182 21 Fernandez-Saiz P, Lagaron JM, Hernandez-Muñoz P, Ocio MJ (2 008) Characterization of antimicrobial properties on the growth o f S. aureus of novel renewable blends of gliadins and chitosan of interest in food packaging and coating applications. Int J Food Mi crobiol 124(1):13-20 22 Goy RC, Britto DD, Assis OB (2009) A review of the antimicrobial activity of chitosan. Polímeros 19(3):241-247 23 Shahidi F, Arachchi JK, Jeon YJ (1999) Food applications of chitin and chitosans. Trends Food Sci Technol 10(2):37-51 24 Garcia MA, Pinotti A, Zaritzky NE (2006) Physicochemical, water vapor barrier and mechanical properties of corn starch and c hitosan composite films. Starch-Stärke 58(9):453-463 p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 1 8 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

22. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 21 ET1BIOFRE Bibliografía más relevante • Marsh, K. & Bugusu, B., 2007. Food Packaging Roles, Materials and Environmental Issues. Journal of Food Science, pp. 39-55. • FAO, 2011. Appropriate food packaging solutions for developing countries, Düsseldorf: International Congress INTERPACK. • Ayhan, Z., 2011. Effect of packaging on the quality and shelf life of minimally processed ready to eat. Academic Food Journal, pp. 36-41 • Catalá, R., Hernández, P., Lopez, G. & Gavara, R., 2009. Materiales para el envasado de frutas y hortalizas con tratamientos mínimos. Horticultura Internacional, pp. 60-65 • Kader, A.A, 2002. Quality of fresh-cut fruit and vegetable products. En: Fresh-cut fruit and vegetables. Science, Tecnology and market. O., Lamikanra (Ed). Boca Ratón: CRC Press. 11-28. • Corbo, M.R.; Altieri, C.; D ́Amato, D.; Campaniello, D.; Del Nobile, M.A.; Sinigaglia, M. 2006. Effect of temperature on shelf life and microbiobial population of lightly processed cactus pear fruit. Postharvest Biol. Tec. 31, 93-104. • Suppakul, P.; Miltz, J.; Sonneveld, K; Bigger, S.W. 2003. Active packaging technologies with emphasis on antimicrobial packaging and its applications. Journal of Food Science. 68, 408-420. • Artés, F.; Artés-Hernández., F. 2000. Fundamentos y diseño de instalaciones para procesado en fresco de hortalizas. Aliment. Equip. Tecnol. 3, 135-145. • Parry, R.T. 1993. Envasado de los alimentos en atmósfera modificada. Ed. A. Madrid Vicente. Cap.1, 1-18. • Kader, A.A.; Zagory, D.; Kerbel, D.L. 1989. Modified atmosphere packaging of fruits and vegetables. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 28, 1-30 p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 2 2 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

24. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 23 ET1BIOFRE Figura 2: Extrusora de “compounding” Figura 3: Cabezal tricapa con tres extrusoras p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 2 4 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

26. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 25 ET1BIOFRE 5.2. MATERIALES PLÁSTICOS. El proyecto se ha basado en la utilización de materiales comercialmente disponibles para compararlo con un producto comercial a partir de plásticos tradicionales. De esta manera se seleccionaron tres bioplásticos, con la mayor cantidad de materia de origen renovable posible y cumpliesen con la norma UNE-EN-ISO 13432: • Plástico convencional, referenciado como F0, es un plástico comercial que se utiliza como blanco en la validación de los biofilms. El material es PA/PE (Coex. Multicapa), espesor de 20 / 70 Micras, peso material 87 grs. / m2, temperatura aprox. Soldadura de 110º C, resistencia térmica de - 40º C / +80ºC, permeabilidad al oxígeno de 50 cc / m2 /24 h. 23º C, permeabilidad carbónico 150 cc / m2/24 h. 23º C, permeabilidad nitrógeno 10,0 cc / m2 /24 h. 23º C y permeabilidad vapor de agua 2,60 g / m2 /24 h 23º C /85 % HR. • PBE 001 de Natureplast. Resina de biopoliester termoplástica. Es reciclable e industrialmente compostable según UNE-EN-ISO 13432:2000. Está diseñada para aplicaciones de extrusión. p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 2 6 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

27. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 26 ET1BIOFRE Tabla 2: propiedades del PBE 001 p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 2 7 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

33. En las Figura 5, Figura 6, Figura 7 y Figura 8 se muestran las bolsas de films utilizados en los ensayos: Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 32 ET1BIOFRE Figura 5: Rollos de bolsas F8 y F9 Figura 6: Bolsas F0, F4, F5 y F6 Figura 7:Rollos de bolsas F4, F5 y F6 Figura 8: Bolsas F0, F8 y F9 p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 3 3 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

63. ESTUDIO Y DESARROLLO DE FILMS BIODEGRADABLES PARA ENVASADO DE ALIMENTOS FRESCOS O MÍNIMAMENTE PROCESADOS Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa ET1 BIOFRE MODALIDAD 1. PROYECTOS I+D INDEPENDIENTE Num. Expediente: 2019.08.CT01.0035 p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 6 3 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 2 0

23. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 22 ET1BIOFRE 5. MATERIALES Y MÉTODOS Las formulaciones de los plásticos biodegradables se han extruido en la planta piloto de CETEC (Figura 1). En concreto, las formulaciones de los plásticos con los aditivos se han extruido primero en la extrusor a de “compoundin”g Lesistritz 18HP, de doble husillo corrotante con una configuración del husillo especial para formulaciones de polímeros biodegrables (Figura 2). Por otro lado, el tubo multicapa .para envasar los alimentos se ha extruido en una cabezal tricapa Collins, con tres extrusoras acopladas (Figura 3). Figura 1 Planta piloto de CETEC p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 2 3 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

28. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 27 ET1BIOFRE Tabla 3: Propiedades del NP SF 141 El material se debe secar un mínimo de 5 horas a 70ºC hasta obtener una humedad inferior a 250 ppm. • NP SF 141 de NaturePlast. Resina termoplástica de PLA producida a partir de fuentes renovables de origen vegetal que ofrece una menor rigidez y un mayor alargamiento de rotura con respecto al PLA estándar. • Bio-Flex® F 1804 de FKUR. Compuesto de polímero biodegradable y compostable casero adecuado para aplicaciones de película soplada. Certificado como compostable casero según la norma EN 13432 (a temperatura ambiente) con un espesor máximo de 27 _m. El contenido de carbono de base biológica (BCC) es del 43% (determinado de acuerdo con ISO 16620). Es adecuado para uso en aplicaciones como bolsas de frutas. p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 2 8 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

30. Tabla 6:Formulaciones desarrolladas Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 29 ET1BIOFRE A partir de las formulaciones anteriores se han diseñado diferentes films tricapa, que se han extruido en la extrusora Collins y que se exponen a continuación: p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 3 0 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

60. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 59 ET1BIOFRE 7. CONCLUSIONES De acuerdo a los resultados obtenidos en el estudio de los parámetros físico-químicos, sensoriales y microbiológicos de muestras de tomate, plátano, manzana y lechuga envasada en films codificados como F0 (film comercial de polipropileno), F4, F5, F6, F8 y F9 se puede concluir. 1. La ganancia de peso en las muestras muestra fallos en la propiedades del film para el termosellado. Los films F5 son los que presentan un peor termosellado independientemente del producto envasado. La muestra de plástico convencional (F0) son las que presentan mejores propiedades de termosellado. La pérdida de peso en las muestras f8 y f9 ponen de manifiesto una permeabilidad a través del film del etileno que se produce como consecuencia de la maduración en el caso del plátano. 2. Esta falta de estanqueidad en los productos envasados en el film F4, F5 y F6 muestran un mayor crecimiento de los microorganismos aeróbios mesófilos en todos los productos envasados, excepto en las muestras de tomate, que no existe crecimiento en ninguna de las muestras. 3. La evolución del color de las muestras de tomate no se ven afectadas por el material del films en el que está envasado. Con respecto al plátano son las muestras envasadas en el Film F6 y F9 las que mejor mantienen la apariencia de la piel del plátano. 4. Las muestras de lechuga y manzana troceadas se descartan en el estudio porque el hecho de la manipulación de los productos influye en los resultados de la comparación de los plásticos. 5. El envasado de manzanas enteras en los distintos films no parece verse afectado por el tipo de film durante los 21 días de almacenamiento. 6. En el caso de la lechuga romana los films F5, F6 y F9 son los que mejor propiedades presentan para su almacenamiento durante 21 días a 4ºC. 7. Los films F6 y F9 son la mejor alternativa al plástico convencional F0 para el envasado de lechuga, manzana, tomate y plátano. 8. En general los films biodegradables o en este caso compostables se han comportado de forma similar a los films convencionales en cuanto a la procesabilidad de los mismos. Es cierto, que alguno de ellos cuesta más termosellarlo pero es una cuestión que se puede mejorar en sucesivas formulaciones. 9. Por otro lado, si bien la permeabilidad al oxígeno es mayor en los films biodegradables que en la muestra testigo, también es mayor la permeabilidad al etileno, lo que puede ser una ventaja de estos films con p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 6 0 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 2 0

62. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 60 ET1BIOFRE • Los envases complejos multicapa presentan distintos materiales en una misma estructura: diferentes polímeros, metales o adhesivos. https://www.european-bioplastics.org/ • Marsh, K. & Bugusu, B., 2007. Food Packaging Roles, Materials and Environmental Issues. Journal of Food Science, pp. 39-55. • Parry, R.T. 1993. Envasado de los alimentos en atmósfera modificada. Ed. A. Madrid Vicente. Cap.1, 1-18. • Siracusa, V., Rocculi, P., Romani, S., & Dalla Rosa, M. (2008). Biodegradable polymers for food packaging: a review. Trends in Food Science & Technology, 19(12), 634-643. • Suppakul, P.; Miltz, J.; Sonneveld, K; Bigger, S.W. 2003. Active packaging technologies with emphasis on antimicrobial packaging and its applications. Journal of Food Science. 68, 408-420. p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 6 2 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 2 0

5. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 04 ET1BIOFRE de alimentos de mayor valor añadido (carne y pescado). Sin embargo, en el caso del envasado de frutas y hortalizas frescas, de menos valor añadido, pero de gran consumo y claves para economías regionales como la murciana, aun no se ha encontrado una solución realmente viable que mantenga un equilibrio entre todas las necesidades que demanda el mercado: • Envase biodegradable, minimizando el impacto al medioambiente. • Envase que proteja al alimento durante al menos la misma vida útil que el convencional. • Precio del envase asumible por el consumidor y el fabricante. • Envases adaptados a la necesidad de cada hortaliza. Este trabajo se centra en el estudio y desarrollo de films biodegradables válidos para envasado de frutas y verduras frescas y de IV Gama. A partir de los resultados obtenidos, el CETEC ha elaborado una guía práctica que servirá de ayuda a los operadores del sector en la transición del uso de films convencionales al uso de films biodegradables para envasado de frutas y verduras. 2. OBJETIVOS 2.1. OBJETIVOS GENERALES El objetivo general de este proyecto, ET1BIOFRE, es la elaboración de una guía de práctica aplicación basada en el estudio y la validación de los films biodegradables desarrollados en el ámbito de este proyecto para el envasado de alimentos frescos o mínimamente procesados, denominados IV Gama. El objetivo general de CETEC en este proyecto es el desarrollo de films biodegradables, a partir de aquellos presentes en el mercado, válidos para su aplicación en el envasado de alimentos frescos o mínimamente procesados, denominados IV Gama. El objetivo general de CTC en este proyecto ha sido la validación de los films biodegradables desarrollados en el envasado de alimentos frescos o mínimamente procesados. p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 5 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

6. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 05 ET1BIOFRE 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Como objetivos específicos del CETEC se contemplan los siguientes: • Estudio de films biodegradables comerciales válidos para su uso en envase alimentario. • Formulación y caracterización de films biodegradables monocapa • Formulación y caracterización de films biodegradables multicapa para envase alimentario • Mejora de formulaciones y conclusiones prácticas Como objetivos específicos del CTC se contemplan los siguientes: • Selección de las frutas y hortalizas, así como el establecimiento de los parámetros a estudiar y comparar. Se ha realizado un estudio de las frutas y hortalizas que sean utilizado en la validación de los plásticos biodegradables desarrollados, teniendo en cuenta su formato habitual de envasado, el impacto de la producción en la Región de Murcia, la importancia de su exportación, etc. • Validación de los films biodegradables desarrollados. El proceso de validación ha consistido en el envasado de frutas y hortalizas frescas y de IV gama, utilizando las películas plásticas biodegradables desarrolladas y plásticos convencionales no biodegradables. A los alimentos envasados se les ha realizado unos análisis periódicos para determinar la vida útil de los alimentos envasados cumpliendo los criterios de calidad y seguridad alimentaria establecidos en la legislación. 3. CRONOGRAMA Para alcanzar los objetivos propuestos se planteó el siguiente plan de trabajo, dividido en 4 paquetes de trabajo y con una duración de 12 meses. CETEC y CTC han trabajado en colaboración para la consecución de dichos objetivos, realizando las tareas asignadas a cada uno de ellos. Dichas tareas han sido designadas basándose en la experiencia, infraestructura disponible y el know-how de cada uno de ellos, complementándose perfectamente para asegurar el éxito de cada tarea. En el paquete de trabajo-PT1, CETEC y CTC han trabajado en paralelo, recabando toda la información y datos de partida del estudio relativos al rol asignado en este proyecto. p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 6 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

11. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 10 ET1BIOFRE Las hortalizas frescas, crudas, presentan típicamente un alto contenido de agua y nutrientes y un pH aproximadamente neutro. Estas características las hacen aptas para el crecimiento de casi cualquier tipo de microorganismos. en general, las hortalizas se encuentran contaminadas con bacterias y hongos casi en la misma proporción. Usualmente son las bacterias gram negativas las que se aislan a partir de estos productos. Los géneros más frecuentes incluyen pseudomonas, erwinia y enterobacter. Sin embargo, bacterias gram positivas tales como bacillus y corineformes también se encuentran asiduamente. 4.2. ENVASADO DE PRODUCTOS FRESCOS Y MÍNIMAMENTE PROCESADOS El sector de productos IV gama se puede establecer como un mercado de rápido crecimiento debido a la demanda sobre los productos frescos, preparados saludables, convenientes y sin aditivos. Es aquí donde prima el envase como una de las principales tecnologías para reducir o ralentizar el deterioro físico, químico o microbiológico que tiene lugar en mayor o menor media en las sucesivas manipulaciones a que se ven sometidos desde el momento de la recolección hasta su consumo. Actualmente se dispone de una amplia gama de envases de diferentes materiales con características adecuadas para cubrir la diversidad de demandas específicas que plantean las sucesivas fases de la manipulación, transporte, almacenamiento y comercialización de frutas y hortalizas. La utilización de materiales plásticos posibilita el desarrollo de nuevos envases y tecnologías que dan respuesta a las continuas y crecientes demandas de los consumidores de productos frescos o con tratamientos mínimos con las máximas garantías de calidad y seguridad (Catalá, y col., 2009). De acuerdo a la Directiva Europea 94/62/CE un envase se describe como “todo producto fabricado con cualquier material de cualquier naturaleza que se utilice para contener, proteger, manipular, distribuir y presentar mercancías, desde materiales primas hasta acabados, y desde el fabricante hasta el usuario o consumidor". Los envases se pueden separar en primarios, secundarios y terciarios y presentar diferentes funciones como contener el material, función de representación, de información, de servicio, de seguridad y de conservación (Parlamento y Consejo Europeo, 1994). En esta industria las buenas prácticas de fabricación sumadas a la adecuada selección de materiales para su envasado son factores claves para minimizar el deterioro de los productos. De acuerdo con Ayhan, el principal factor para la selección del tipo de material a ser utilizado es el requerimiento o no de contacto con aire para su conservación (Ayhan, 2011). Por lo que, los envases de atmosfera modificada (EAM) han sido ampliamente empleados para conservar la calidad e incrementar el tiempo de vida de este tipo de productos. El concepto básico de los EAM es reemplazar el aire del envase con un gas específico que permita la conservación del producto (Ayhan, 2011). El diseño y producción del envase tiene gran importancia en la determinación del ciclo de vida del alimento. p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 1 1 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

12. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 11 ET1BIOFRE La selección adecuada del material de envase y la tecnología de producción permiten garantizar la conservación de la calidad y la frescura del producto durante su cadena productiva hasta el consumidor final (FAO 2011). La elección de un tipo u otro se basa, en primer lugar, en consideraciones estrictamente científicas: i) generación y/o mantenimiento de una atmósfera determinada en cuanto a la relación O2/CO2, y ii) permeabilidad y facilidad de condensación del vapor de agua, que se relaciona con la facilidad de enmohecimiento, condensación y marchitamiento del producto (Greengras, 1995). En la elección de un film determinado, intervienen también otra serie de factores que podríamos denominar como técnicos, pero que no son menos importantes en el éxito comercial del producto final: facilidad de grabado, maleabilidad, aptitud de sellado resistencia mecánica y a los cambios de temperatura y facilidad de apertura de la soldadura. Las funciones principales de los envases de alimentos son: • Proteger el producto de la influencia externa y su posible daño • Contener el alimento • Informar a los consumidores sobre ingredientes y carga nutricional Las funciones secundarias de los empaques de alimentos son: • Garantizar a trazabilidad del producto • Conveniencia (contraindicaciones) • Información sobre uso y manipulación De acuerdo a lo anterior, el principal objetivo durante la selección del tipo de envase es contener el alimento en una manera costo-efectiva que satisfaga los requerimientos de la industria y los deseos de los clientes, conservando los alimentos seguros y minimizando el impacto ambiental (Marsh & Bugusu, 2007). 4.3. MATERIALES USADOS EN EL ENVASADO DE FRUTAS Y HORTALIZAS FRESCAS Y MÍNIMAMENTE PROCESADAS. PROBLEMÁTICA: Tradicionalmente, las compañías alimentarias utilizan films poliméricos (polietileno PE, polipropileno PP, poliestireno, PS) para envasar frutas y verduras debido a su gran disponibilidad a un coste relativamente bajo con un buen rendimiento mecánico y una buena barrera al oxígeno y al dióxido de carbono 3 . 3 Siracusa, V., Rocculi, P., Romani, S., & Dalla Rosa, M. (2008). Biodegradable polymers for food packaging: a review. Trends i n Food Science & Technology, 19(12), 634-643. p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 1 2 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

13. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 12 ET1BIOFRE El 39.9% del total de plásticos transformados en Europa es utilizado en el sector del envasado y embalaje (19.91 mill Ton). Al tratarse del sector mayoritario para el plástico, también supone el de mayor generación de residuos, tanto a nivel industrial como post-consumo (39%). Muchos envases no se pueden reciclar ya que están formados por diferentes materiales 4 en una misma estructura difíciles de separar, y la mayoría son depositados en vertedero o valorizados energéticamente. Los residuos plásticos tanto de este sector como de otros, están generando un gran problema medioambiental y es que, según la Comisión Europea, representan entre el 80% y el 85% del total de los residuos marinos, y «no cesa de aumentar, lo que afecta a los ecosistemas, la biodiversidad y, potencialmente, la salud humana, y genera una preocupación generalizada El uso extensivo de films sintéticos ha dado lugar a graves problemas ecológicos debido a su baja tasa de biodegradabilidad. Por lo tanto, la biodegradabilidad no es solo un requisito funcional, sino también un atributo ambiental importante 4.4. ESTADO DEL ARTE DE MATERIALES PROCEDENTES DE FUENTES RENOVABLES PARA EL ENVASADO DE ALIMENTOS La era moderna ha experimentado un gran aumento en la venta de productos agrícolas frescos, mínimamente procesados. Estos productos son del tipo listo para cocinar o listo para comer, lo que ofrece varias ventajas a los consumidores. Por otro lado, un envasado adecuado es indispensable para aumentar la vida útil de los productos envasados. Hasta no hace mucho tiempo, los plásticos no biodegradables eran la opción común para los envases debido a su fácil procesabilidad, menor precio y alta resistencia al estrés químico y mecánico. Los plásticos procedentes del petróleo como el polietileno, el poliestireno, el polipropileno y el cloruro de polivinilo poseen buenas características mecánicas y de barrera como la resistencia a la tracción y al desgarro, la permeabilidad al oxígeno, la permeabilidad al dióxido de carbono y la transmisión de aromas. Sin embargo, tales polímeros imponen importantes limitaciones ambientales debido a su procedencia de recursos no renovables y no biodegradabilidad, lo que lleva a graves problemas ecológicos. Debido a estas limitaciones, en los últimos años, la investigación se ha centrado en la obtención de materiales para envases a partir de recursos renovables y, en este sentido, los biopolímeros han ganado cada vez mayor protagonismo. Los biopolímeros para envases son altamente seguros debido a la ausencia de productos químicos nocivos o toxinas; Además, al ser biodegradables, se descomponen en productos inofensivos que se podrían absorber 4 Los envases complejos multicapa presentan distintos materiales en una misma estructura: diferentes polímeros, metales o adhes ivos. p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 1 3 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

14. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 13 ET1BIOFRE en el suelo. En las últimas dos décadas, el desarrollo y uso de materiales para envasado a base de biopolímeros para alargar la vida útil de los productos frescos ha recibido cada vez mayor atención. Los biopolímeros se pueden dividir en tres clases según su fuente: polímeros formados por un proceso químico que utiliza monómeros renovables como precursores como el ácido poliláctico, polímeros como los polihidroxialcanoatos sintetizados a partir de microorganismos y polímeros directamente extraídos de la biomasa vegetal o animal, incluidos los polisacáridos y las proteínas. Tabla 1: Tipos de biopolímeros según su procedencia Por ejemplo, la goma guar es un heteropolisacárido que tiene una cadena principal de manosa que se obtiene del endospermo de una planta leguminosa, la Cyamopsis tetragonoloba. A pesar de la abundancia natural de biopolímeros, su uso en el envasado de alimentos es limitado debido a sus propiedades mecánicas y de barrera inferiores en comparación con los materiales de envasado a base de polímeros procedentes del petróleo. Por lo tanto, se han propuesto varios métodos físicos y químicos como el tratamiento térmico, la irradiación gamma, la modificación química y la incorporación de varios aditivos como nanoarcillas y plastificantes para superar la limitación de los envases basados en biopolímeros. Las redes de proteínas pueden lograr fácilmente enlaces covalentes intermoleculares fuertes, empaquetamiento molecular cercano y movilidad reducida del polímero mediante reticulación por tratamiento térmico 5 . Las propiedades funcionales de las películas también se pueden mejorar mediante la modificación química de las biomoléculas. Por ejemplo, el porcentaje de alargamiento de films a base de proteína de soja aumentó significativamente cuando se trata levemente con un álcali 6 . El tratamiento físico, como la exposición de los biopolímeros a la radiación ionizante, puede causar el ordenamiento de las cadenas poliméricas, lo que resulta en una mejor resistencia mecánica para films a base de goma guar 7 5 Liu CC, Tellez-Garay AM, Castell-Perez ME (2004) Physical and mechanical properties of peanut protein films. LWT-Food Sci Tec hnol 37:731-738 6 Brandenburg AH, Weller CL, Testin RF (1993) Edible films and coatings from soy protein. J Food Sci 58:1086-1089 7 Saurabh CK, Gupta S, Bahadur J, Mazumder S, Variyar PS, Sharma A (2013) Radiation dose dependent change in physiochemical, mechanical and barrier properties of guar gum based films. Carbohydr Polym 98:1610-1617 p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 1 4 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

15. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 14 ET1BIOFRE . La elasticidad de los films es otra propiedad vital para las aplicaciones de envasado, y se puede mejorar mediante la adición de plastificantes como el glicerol. Por lo tanto, hay varios métodos disponibles para mejorar las características funcionales de los films biodegradables. Dichas películas modificadas o tratadas pueden usarse adecuadamente como material de envasado de alimentos para la extensión de la vida útil de los alimentos, lo que posteriormente minimiza el uso de plásticos convencionales. 4.4.1. Importancia de los envases en frutas y verduras recién cortadas Las frutas y verduras son componentes esenciales de una dieta saludable. El valor nutricional de los vegetales radica en su contenido de micronutrientes, contenido de fibra y compuestos bioactivos. Los micronutrientes en los vegetales generalmente están compuestos de vitaminas y minerales que los humanos requieren en pequeñas cantidades para organizar una serie de funciones fisiológicas. Aunque estos micronutrientes se requieren en pequeñas cantidades, su deficiencia puede causar enfermedades en humanos. Las pautas dietéticas de la OMS nos recomiendan consumir entre tres y cinco porciones de verduras al día 8 . Se recomienda una ingesta diaria de 400 g de frutas y verduras 9 . Debido a la existencia de un tiempo mínimo de preparación antes del consumo de frutas y verduras mínimamente procesadas, estas están ganando importancia en los establecimientos minoristas de alimentos. Los productos agrícolas frescos se han transformado en productos listos para comer o listos para cocinar para aumentar su comodidad de uso sin alterar significativamente sus características de productos frescos. El mercado de frutas y verduras mínimamente procesadas está en aumento en Europa en las últimas tres décadas. Además, de manera similar en los EE. UU., las ensaladas envasadas y las verduras recién cortadas se encuentran entre los artículos de venta más rápidos en los supermercados. En Asia, el mercado de productos frescos cortados también abarca una parte importante de todos los productos vendidos en el mercado minorista. La Asociación Internacional de Productos Frescos (IFPA) 10 definió los productos frescos cortados como: pelados, lavados y cortados en productos 100% utilizables que posteriormente se envasan o preenvasan para ofrecer a los consumidores una alta nutrición, conveniencia y valor mientras mantienen la frescura. Las prácticas mínimas de preparación de productos incluyen pelado, corte, lavado, tratamientos con agentes desinfectantes, secado, etc. Estas operaciones de procesamiento alteran la integridad física de estos productos, haciéndolos más susceptible al deterioro que las materias primas originales 11 . 8 https://www.who.int/dietphysicalactivity/fruit/es/index1.html 9 Lock K, Pomerleau J, Causer L, Altmann DR, McKee M (2005) The global burden of disease attributable to low consumption of fru it and vegetables: implications for the global strategy on diet. Bull World Health Organ 83:100-108 10 https://www.unitedfresh.org/ 11Banerjee A, Chatterjee S, Variyar PS, Sharma A (2016) Shelf life extension of minimally processed ready-to-cook (RTC) cabbage by gamma irradiation. J Food Sci Tech 53:233-244 p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 1 5 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

16. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 15 ET1BIOFRE La rotura de los productos frescos durante las operaciones de procesamiento los hace vulnerables a la contaminación a través del crecimiento del deterioro o la supervivencia de bacterias patógenas. Alrededor del 80-90% de los patógenos alimentarios son gramnegativos, que incluyen principalmente especies de Pseudomonas, Enterobacter o Erwinia. Las levaduras comúnmente incluyen Cryptococcus, Rhodotorula, Candida, Aureobasidium, Fusarium, Mucor, Phoma, Rhizopus y Penicillium. Las bacterias patógenas pueden incluir Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum, Aeromonas hydrophila, Escherichia coli, Salmonella, Yersinia enterocolitica y Campylobacter jejuni 12 . El procesado industrial acelera la degradación de los productos agrícolas mínimamente procesados y conduce a cambios bioquímicos, como un aumento en la tasa de respiración que acelera los procesos de oxidación, la degradación de las membranas celulares y el pardeamiento enzimático, y la pérdida de la textura del tejido. La preservación general de las cualidades sensoriales, nutricionales y microbianas de los productos frescos es un gran desafío para las industrias de alimentos frescos. Los productos agrícolas mínimamente procesados pueden conservarse mediante el uso de técnicas tales como refrigeración, conservantes, tratamientos térmicos suaves, procesamiento por microondas, disminución de la actividad del agua, radiación ionizante, tecnología de alta presión, campo eléctrico pulsado de alta intensidad, desinfectantes de luz pulsada, tecnología de ozono, etc 13 . Sin embargo, un envasado adecuado es indispensable para el mantenimiento de la calidad general de los productos procesados. Si bien los envases hechos con plásticos procedentes del petróleo se han utilizado como material de embalaje durante un tiempo considerable, la era moderna está experimentando una aversión hacia su uso debido a la preocupación ambiental. Además, al estar en contacto directo con el producto, los materiales convencionales para envasado de alimentos pueden ser una fuente de contaminantes por la migración de productos químicos desde el envasado a los alimentos. Por lo tanto, se hace más hincapié en el uso de envases alimentarios basados en biopolímeros. Se ha trabajado mucho para el desarrollo de envases de alimentos independientes a partir de biomasa para poderlos comercializar en las industrias alimentarias. 4.4.2. Fuentes de polímeros biodegradables Las películas biodegradables se pueden dividir en tres categorías según sus componentes: hidrocoloides, lípidos y composites. Los hidrocoloides son polímeros hidrofílicos de origen natural (incluidas proteínas y polisacáridos) o sintéticos que generalmente forman un gel en agua debido a la presencia de muchos grupos hidroxilo; por lo tanto, tienen una excelente capacidad de formación de película. Los lípidos se 12 Lund BM (1993) The microbiological safety of prepared salad vegetables. Food Technology International, Norwich, United Kingd om 13 Siddiqui MW, Chakraborty I, Ayala-Zavala JF et al (2011) Advances in minimal processing of fruits and vegetables: a review. J Sci Ind Res 70(9):823-834 p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 1 6 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

19. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 18 ET1BIOFRE presencia de quitosano proporciona propiedades antimicrobianas al film, extendiendo así la vida útil de los productos envasados. Tales bolsas compuestas podrían proteger los espárragos, el maíz baby y la col china contra el deterioro de Staphylococcus aureus y la consecuente intoxicación alimentaria 25 . Se ha demostrado que las formulaciones de recubrimientos a base de quitosano, así como los films de este material, prolongan la vida útil de una amplia variedad de alimentos como plátano, mango y pimiento debido a su propiedad antimicrobiana 26 . La aplicación de quitosano induce la producción de enzimas de defensa de las plantas, como la quitinasa, que lo protege del ataque de hongos e invertebrados. Los films biodegradables que incorporan un agente antimicrobiano se pueden usar en el envasado de alimentos para reducir las cargas microbianas, extendiendo así la vida útil de las frutas y verduras. La ventaja del quitosano es ser inherentemente antimicrobiano, por lo que los films a base de quitosano prolongan la vida útil de los productos envasados sin ninguna clase de aditivo. La celulosa consiste en una cadena lineal de unidades de D-glucosa unidas a _ (1 _ 4). Se utilizan varios derivados de celulosa para el desarrollo de films con propiedades mejoradas en comparación con las películas de celulosa nativas. Las películas de acetato de celulosa se usan más ampliamente en el envasado de alimentos que otros derivados debido a sus propiedades barrera contra gases y humedad mejores que otros polímeros. Se han realizado muchos estudios en films compuestos de quitosano-celulosa. La celulosa y el quitosano forman films compuestos homogéneos debido a las similitudes en sus estructuras primarias que dan como resultado excelentes propiedades funcionales. Este tipo de films ha demostrado ser efectivo para mejorar la vida útil de las muestras envasadas al mantener una atmósfera óptima dentro de los paquetes. Aunque la celulosa posee excelentes propiedades como film, debido a su alto costo, no es factible usarlas para la preparación de películas biodegradables a escala comercial. 4.4.2.1.4. Alginato El alginato se extrae de las algas marinas y está compuesto principalmente por un copolímero lineal de monómeros de ácido D-manurónico y L-gulurónico. Posee buenas propiedades de formación de films que hacen que el alginato sea muy valioso en aplicaciones alimentarias. Los cationes divalentes como Ca2+, Mg 2+ , Mn 2+ o Fe 2+ se usan como agentes gelificantes en la preparación de films de alginato. El calcio es más eficiente en la gelificación del alginato en comparación con otros cationes. Las propiedades de los films de alginato pueden modificarse aún más incorporando almidón, oligosacáridos o simplemente azúcar. Se han investigado las propiedades físicas y antioxidantes de la película de alginato incorporada con 25 Pitak N, Rakshit SK (2011) Physical and antimicrobial properties of banana flour/chitosan biodegradable and self sealing fil ms used for preserving fresh-cut vegetables. LWT Food Sci Technol 44:2310-2315 26 Azeredo HM, de Britto D, Assis O (2010) Chitosan edible films and coatings-a review. Ed. Davis PS In: Chitosan: manufacture, properties, and usage. New York: New Science Publishers 179-194 p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 1 9 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

29. Tabla 4: propiedades del Bio-Flex F 1804 Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 28 ET1BIOFRE • Arcillas KW-2200: de estructura laminar y con una superficie específica de 125m2/g. A partir de los bioplásticos anteriores se han extruido en la extrusora Leistritz las siguientes formulaciones base: Tabla 5: Formulaciones Base p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 2 9 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

31. Tabla 7:Datos de permeabilidad de las formulaciones desarrolladas Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 30 ET1BIOFRE La formulación BIOFRE F7 no pudo extruirse por soplado. Se realizó la permeabilidad al oxígeno de los films obtenidos en un equipo Mocon Ox-Tran. La adición de la arcilla en el caso de la muestra BIOFRE F8 reduce la transmisión en un 56%, lo cual es bueno dependiendo del metabolismo del fruto a envasar. Como referencia se ha tomado el Plástico F0, el cual, es un plástico comercial que se utiliza como blanco en la validación de los biofilms. El material es PA/PE (Coex. Multicapa), espesor de 20 / 70 Micras, peso material 87 grs. / m 2 , temperatura aprox. Soldadura de 110º C, resistencia térmica de - 40º C / +80ºC, permeabilidad al oxígeno de 50 cc / m 2 /24 h. 23º C, permeabilidad carbónico 150 cc / m 2 /24 h. 23º C, permeabilidad nitrógeno 10,0 cc / m 2 /24 h. 23º C y permeabilidad vapor de agua 2,60 g / m 2 /24 h 23º C /85 % HR. 38 La formulación BIOFRE F7 no se pudo extruir mediante la técnica de film soplado 38 p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 3 1 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

53. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 52 ET1BIOFRE Tabla 30: ”. Evolución del parámetro de color “a/b” en manzanas troceadas En la Tabla 31y la Figura 17 se muestran los valores de color de los parámetros “L” y “a/b” de las manzanas sin trocear envasadas en los films f0, f4, f5, f6, f8 y f9 Tabla 31: . Evolución del parámetro de color “L” en manzanas enteras Figura 17: Evolución del parámetro a/b en manzanas enteras p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 5 3 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

54. Los valores del parámetro Cielab de color (a/b) muestra que las manzanas envasadas en los films f4, f5 y f6 son las que muestran mayor variación en el color, debido posiblemente a la entrada de aire durante el almacenamiento de las mismas. En la Tabla 32 se muestran imágenes de las distintas muestras de manzana troceadas y envasadas en distintos films durante los 21 días de almacenamiento a 4 ° C. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 53 ET1BIOFRE Tabla 32: Imágenes de las manzanas troceadas y enteras p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 5 4 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

57. Tabla 35: Evolución del parámetro de color “L” en plátano Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 56 ET1BIOFRE La Tabla 36 muestra la apariencia de las muestras de plátano envasadas en los distintos films durante 21 días almacenados en refrigeración Figura 19: Evolución del color a/b en plátanos Tabla 36: Imágenes de plátanos p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 5 7 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 2 0

17. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 16 ET1BIOFRE definen ampliamente como moléculas hidrófobas o anfifílicas que incluyen ceras, acilgliceroles y ácidos grasos. Los composites están formados por dos o más constituyentes (hidrocoloides o lípidos) para producir una amalgamación con características mejoradas que la de los componentes individuales. Se han realizado amplias investigaciones sobre proteínas y películas de polisacáridos debido a que tienen propiedades fisicomecánicas adecuadas. Dichas películas pueden mantener la condición aeróbica alrededor de los productos envasados, lo que extiende su vida útil 14 . 4.4.2.1. Polisacáridos Los polisacáridos son largas cadenas de unidades de monosacáridos unidas por enlaces glucosídicos. Debido al procesamiento simple y la amplia disponibilidad, se han realizado más investigaciones sobre biopolímeros a base de carbohidratos que sobre proteínas para el desarrollo de envases biodegradables. 4.4.2.1.1. Almidón El almidón (polímero de glucosa) es un compuesto de almacenamiento producido por la mayoría de las plantas verdes que consiste en unidades de amilosa lineal y amilopectina ramificada. Se usa más comúnmente para la producción de films porque es barato, abundante, biodegradable y fácil de manejar 15 . De hecho, el primer film comercial biodegradable se desarrolló a partir de una mezcla de almidón granular y polímeros sintéticos 16 . El almidón termoplástico se puede producir usando una extrusora que aplica energía térmica y mecánica al almidón, el cual se comercializa debido a sus excelentes propiedades, y hoy domina el mercado de materiales compostables de base biológica 17 . Los films a base de almidón tienen propiedades de barrera a los gases moderadas que pueden mejorarse reestructurando la conformación nativa del almidón y agregando sustancias sintéticas. Cuando se mezcla el almidón con glicerol como plastificante, los filmss resultantes mejoran la vida útil de las fresas de 14 a 21 días 18 . Además, en los estudios anteriores, el contenido de glicerol tuvo un efecto significativo sobre las propiedades mecánicas de las películas. La resistencia a la punción disminuyó de 14.6 a 12.1 N con un aumento en el contenido de glicerol de 1.3 a 2 g/100 g de solución. Se ha estudiado el efecto de la cera de abejas como plastificante en filmss comestibles a base de almidón de guisante. Se ha demostrado que las películas desarrolladas tienen una baja permeabilidad al vapor de agua debido al componente hidrófobo 14Hernandez-Izquierdo VM, Krochta JM (2008) Thermoplastic processing of proteins for film formation-a review. J Food Sci 73(2): R30- R39 15 Parra DF, Tadini CC, Ponce P et al (2004) Mechanical properties and water vapor transmission in some blends of cassava starc h edible films. Carbohydr Polym 58(4):475-481 16Guilbert S, Gontard N, Cuq B (1995) Technology and applications of edible protective films. Packag Technol Sci 8(6):339-346 17Shalini RA, Singh AN (2009) Biobased packaging materials for the food industry. J Food Sci Technol 5:16-20 18Mali S, Grossmann MV (2003) Effects of yam starch films on storability and quality of fresh strawberries (Fragaria ananassa). J Agric Food Chem 51(24):7005-7011 p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 1 7 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

25. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 24 ET1BIOFRE Todas las pruebas que se han realizado en este proyecto y que requerían contacto directo con los alimentos se han realizado en la sala blanca del CTC con la finalidad de controlar la posible contaminación ambiental de los productos. Esta sala blanca respeta las normativas iso 14644 con las condiciones de diseño propias de estas zonas de trabajo en cuanto al flujo de personas, materiales, equipos y desechos. Los parámetros ambientales que se deben regular en estas salas son la temperatura, presión, humedad relativa, flujo de aire, iluminación y número de partículas. en concreto la sala ultralimpia del CTC cuenta con una superficie de trabajo de 50 m2, que garantiza el suficiente espacio de trabajo con la maquinaria necesaria; filtros microbiológicos HEPA modelo n-1000 μ m, para controlar el tamaño y número de las partículas y microorganismos en suspensión, equipo de ventilación que garantiza la correcta renovación del aire de la sala con la frecuencia necesaria; presurizada con presión positiva con el objetivo de impedir la entrada de aire desde el exterior; la temperatura constante a 4ºc, para mantener unas buenas condiciones de conservación de los alimentos; el flujo de aire, iluminación y la humedad también son constantes y acordes a los valores críticos para este tipo de sala. 5.1. MATERIAS PRIMAS TOMATE: Tomates, variedad Pera o tomate Roma, adquiridos en un comercio cercano, en perfecto estado de maduración, esta variedad es ideal para conservas debido a su carnosidad y sabor dulce, procedentes de Andalucía y almacenados en la cámara de refrigeración a 4 ºC. LECHUGA: La variedad iceberg tiene forma redondeada, sus hojas forman una bola alrededor del tallo y se contraen una contra otra de forma natural. Su textura es entre lisa y rugosa pero además es crujiente. La variedad de lechuga romana es una variedad de lechuga que crece con una larga cabeza y que posee una hojas robustas, alargadas y con un robusto nervio central. Al contrario que otras lechugas es más tolerante al calor. PLÁTANO. En Canarias se cultivan principalmente plátanos del grupo 'Cavendish', es decir, cultivares triploides de Musa acuminata, identificados en la terminología de variedades de plátano con las letras AAA (tres juegos de cromosomas procedentes de M. acuminata y ninguno de M. balbisiana). Son frutos de tamaño medio, piel amarilla delgada y que son aptos para consumirse crudos. MANZANA. Las manzanas de tipo Golden, provienen de una serie de selecciones y mutaciones de la variedad Golden Delicious. Tienen un atractivo color amarillo, son de gran calibre, se conservan muy bien y se consideran de una calidad gustativa alta. Su piel es amarilla verdosa con pequeños puntos oscuros. p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 2 5 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

37. localiza directamente sobre la plataforma y actúa como guía para la cuchilla mientras el producto se sustenta en ella. Medidas de color Para las medidas de color como coordenadas CIELab (L*, a* y b*), se utilizó un colorímetro Minolta CR-200 (Osaka, Japón). El parámetro L* indica la luminosidad y los parámetros a* y b* son las coordenadas de cromaticidad, verde- rojo y azul-amarillo, respectivamente. L* nos da una medida aproximada de la luminosidad, que es la propiedad según la cual cada color puede ser considerado como equivalente a un miembro de la escala de grises, entre negro y blanco, tomando valores dentro del rango 0 (negro) a 100 (blanco). El parámetro a* toma valores positivos para los colores rojizos y negativos para los verdosos, mientras que b* toma valores positivos para los colores amarillentos y negativos para los azulados (Pérez-López y col., 2007). El iluminante considerado como estándar fue el D65, como referencia se tomo el Observador Estándar Colorimétrico Suplementario 1964 u Observador de 10º. Como blanco estándar se consideró una cubeta con agua destilada. Los datos de color obtenidos correspondieron a la media de tres medidas, determinados como coordenadas CIELab. Antes de empezar el proceso de medida, el equipo se calibra con una teja blanca de parámetros conocidos. Tras ello, se coloca la mitad de alcachofa hacia arriba sobre un recipiente blanco (minimizando así posibles errores en la medida), aplicando el brazo medidor directamente sobre el centro de la mitad de alcachofa, emitiendo a continuación tres disparos de luz. Todas las medidas se realizaron por triplicado. 5.5. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS Recuento de aerobios mesófilos En condiciones estériles, se pesaron aproximadamente 10 g de cada muestra en una bolsa de plástico especial para homogeneizadores, añadiendo 90 mL de agua de peptona (Biorad, Francia), obteniendo así una dilución 1/10. Ambas operaciones se realizaron en un equipo de alta precisión, que permite la pesada de la muestra y el cálculo automático de la cantidad de diluyente necesaria para obtener la dilución deseada (Delta dilutor, España) y a continuación se introdujo la bolsa en un homogeneizador (Stomacker, España) durante 30 segundos. A partir de la primera dilución (dilución madre), se toma 1 mL de ésta y se pasa a un tubo con 9 mL de agua de peptona (dilución 1/100). Se repite esta operación si se desean mayores diluciones. Tras esta operación, se procedió a la siembra en placa Petri por duplicado, depositando 1 mL en cada una de ellas y entre 15-20 mL aproximadamente de agar de recuento en placa (PCA, Scharlau, España), licuado y atemperado en cada placa. El PCA contiene 5g/L de peptona de Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 36 ET1BIOFRE p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 3 7 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

40. Recuento de mohos y levaduras Los mohos son hongos multicelulares filamentosos, dotados de un micelio verdadero, microscópico y cuyo crecimiento en los alimentos y en el medio de cultivo, se conoce fácilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso. Las levaduras son hongos que crecen generalmente en forma de agregados sueltos de células independientes, que pueden ser globosas, ovoides, piriformes, alargadas o casi cilíndricas. En algunos casos forman cadenas de células alargadas. Cuando crecen en los alimentos y medios de cultivo, forman colonias de aspecto característico semejantes a las de las bacterias. El significado de la contaminación fúngica de los alimentos radica no sólo en el potencial para deteriorarlos, sino en el caso de los mohos por su capacidad para producir sustancias tóxicas (micotoxinas) para el hombre y los animales. Para la preparación de la muestra y las diluciones seriadas se siguió el procedimiento descrito para aerobios mesófilos. A continuación, se procedió a la siembra por duplicado en placa Petri, depositando 1 mL en cada una de ellas y entre 15-20 mL aproximadamente de medio agar extracto rosa de bengala (Scharlau, España), a una temperatura entre 45-48 ºC. El rosa de bengala contiene 5g de peptona, 0,5g de sulfato magnésico heptahidratado, 0,1g de cloranfenicol, 1g de fosfato dipotásico, 10g de glucosa, 0,5g de rosa de bengala (5% p/v) y 15g de agar. Tras ello, se homogeneiza correctamente el inóculo y el medio de cultivo, dejando solidificar en una superficie horizontal a temperatura ambiente. Una vez solidificadas, se invierten las placas y se incuban entre cinco y siete días a 25 ºC. Para la lectura, se cuentan las placas cuyo número de colonias esté comprendido entre 0 y 50 y se halla la media. Si se produce un desarrollo excesivo, se cuentan primero las colonias a los tres días, repitiendo el conteo al cabo de cinco días. El número contado se multiplica por el factor de dilución y los resultados se expresan en unidades formadoras de colonias de mohos y levaduras por gramo (Ministerio de Sanidad y Consumo, 2000). 5.6.ANÁLISIS ESTADÍSTICOS Para determinar las diferencias significativas entre las muestras sometidas a diferentes tratamientos, todos los datos obtenidos se sometieron a un análisis de varianza (ANOVA) y a un test multivariante de Tukey. La interacción se consideró significativa cuando la probabilidad fue p ≤ 0,05. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el soporte informático SPSS 19.0 (SPSS Ciencias, Chicago, USA). Los datos experimentales representan la media de al menos 3 determinaciones independientes, cada una de las cuales se repitió por duplicado. Para realizar el ajuste de los datos se utilizó el programa Microsoft Excel 2007. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 39 ET1BIOFRE p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 4 0 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

56. La Tabla 34 muestra la apariencia de las muestras de tomate envasadas en los distintos films Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 55 ET1BIOFRE Tabla 34: Imágenes de tomates De acuerdo a las imágenes la apariencia de los tomates envasados en los distintos films es muy similar, datos que se corroboran con los resultados de color y textura. Plátano Tanto para el parámetro de color “L” (Tabla 35) y el parámetro de color “a/b” Figura 19) el film que muestra una diferencia significativa en la luminosidad y color de la piel del plátano es el plátano envasado en el film f5 y f8. p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 5 6 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 2 0

42. Se repiten los ensayos en los films F0, F4 ,F5 y F6 junto con dos nuevos materiales de films F8 y F9. En la Tabla 10 se muestran los resultados de la evolución de los para la lechuga variedad romana en los films f0, f4, f5, f6, f8 y f9. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 41 ET1BIOFRE Tabla 10: Evolución del pH en lechuga romana No se observa diferencia significativa en ninguna de las muestras de lechuga romana durante los 21 días de almacenamiento en el valor del pH. Manzana Los resultados de la Tabla 11 muestran un aumento del pH de en todas las muestras de films, pero se observa que las envasadas en el plástico convencional (F0) este aumento es más pronunciado que en el resto de films. Tabla 11: Evolución del pH en manzana troceada Figura 10: Evolución del pH en manzana troceada p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 4 2 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

44. Plátano La tabla 6 muestra que en todas las muestras de plátano no se aprecia un aumento en el valor de pH durante el almacenamiento similar para todos los films. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 43 ET1BIOFRE Tabla 14: Evolución del pH en plátano 6.1.2. Determinación del peso Lechuga Para la evolución del peso se calcula la variación de peso obtenido como diferencia entre el peso inicial y el peso de la misma bolsa el día de su análisis. En la Tabla 15 y Figura 11 se muestra la evolución del peso de la lechuga iceberg durante el tiempo de almacenamiento. Tabla 15: Evolución del peso en lechugas Iceberg, gramos Figura 11: Evolución del peso de las bolsas de lechuga iceberg p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 4 4 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

46. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 45 ET1BIOFRE Figura 12: Evolución del peso de las bolsas de lechuga romana Tal como se aprecia en la gráfica las bolsas de manzana de los films f4, f5 y f6 presentan un aumento de peso durante el almacenamiento por entrada de aire siendo las muestras f0, f8 y f9 las que no presentan entrada de aire. Tomate En las medidas de la variación de peso en las bolsas de tomate almacenadas, se observa que la muestra envasada en los films f5 y f6 son las que presentan aumento de peso debido a la entrada de aire por el cierre o debido a la permeabilidad de los plásticos. Sin embargo, las muestras envasadas en los films fo, f8 y f9 permiten la salida de los gases que se producen debido a la maduración del tomate durante su almacenamiento. En la tabla 10 y en la Figura 13 se muestra la evolución del peso de las muestras de tomate envasadas. Tabla 18: Evolución del peso en tomates, gramos p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 4 6 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

45. La pendiente positiva en la variación del peso de las muestras se debe a un aumento de peso durante el periodo de almacenamiento, lo que indica la entrada de aire por pérdida de estanqueidad del cierre o por la permeabilidad del plástico. En este sentido se observa que el film f5 es el menos estanco para el almacenamiento de la lechuga iceberg. Tal como se observa en la Tabla 16 la diferencia de peso en las distintas muestras de films de lechuga romana sin trocear no es significativa, sin embargo si se aprecia en los films f4, f5 y f6 un aumento de peso que puede deberse a la entrada de aire. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 44 ET1BIOFRE Tabla 16: Evolución del peso en lechuga romana, gramos Manzana En la tabla 9 se muestra la variación del peso de las muestras de manzana troceadas almacenadas durante 21 días en refrigeración. Tabla 17: Evolución del peso en manzanas troceadas, gramos Las muestras envasadas en film F5 presentan una tendencia al aumento de peso desde el inicio del almacenamiento, debido a la entrada de aire del exterior, ya sea por una pérdida de la estanqueidad del cierre o por la permeabilidad del plástico. Con respecto al envasado de manzana sin trocear en la Figura 12 se muestra la evolución del peso de las bolsas de distintos films calculado como diferencia entre el peso final y peso de la muestra a día 0. p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 4 5 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

47. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 46 ET1BIOFRE Figura 13: Variación del peso de tomate en films f0, f4, f5, f6, f8 y f9 Plátano No se observa variación en el peso de las muestras de plátano en ninguno de los films excepto en el film f5 en el que si existe un aumento significativo del peso con respecto a los demás, tal como se muestra en la Tabla 19. Tabla 19: Evolución del peso en plátanos, gramos A diferencia de lo que ocurría con las muestras de films f0, f4, f5 y f6 los plátanos envasados en los films f8 y f9 muestran una pérdida de peso durante el almacenamiento de las muestras en refrigeración, tal como aparece en la Figura 14. p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 4 7 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

55. Tal como se muestra en la Tabla 32 es a partir del día 14 cuando se empieza a observar un pardeamiento en las muestras de manzana troceadas envasadas en los films f4, f5 y f6, manteniendo mejor apariencia las muestras envasadas en el film comercial f0. Sin embargo, en las muestras de manzanas sin trocear no se observa diferencia significativa en la apariencia en ninguna de las muestras envasadas a los 21 días de almacenamiento en ningún tipo de film. Tomate El film utilizado para el envasado de las muestras de tomate no influye en la evolución de los parámetros de color analizados, “L”, en todas las muestras se muestra una disminución similar en la luminosidad, tal como se refleja en la Tabla 33. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 54 ET1BIOFRE Tabla 33: Evolución del parámetro de color “L” en tomates Con respecto a la evolución de la tonalidad del verde al rojo es la muestra envasadas en los films f8 y f9 la que presenta una mayor maduración que se refleja con una tonalidad más roja que las demás muestras, tal como refleja la Figura 18. Figura 18: Evolución del color a/b en tomate p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 5 5 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 2 0

41. 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Una vez envasadas las muestras, tal como se ha descrito en el apartado de materiales y métodos, se almacenan en refrigeración a 4ºC durante el tiempo de duración del control analítico. A continuación se describen los resultados obtenidos durante la ejecución del proyecto. 6.1. ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICOS Durante la vida útil de las frutas (plátanos y manzanas) y los vegetales (tomate y lechuga) se realizan semanalmente las medidas de pH, peso, textura y color de 1 bolsa de cada producto. 6.1.1. Determinación del pH Lechuga La lechuga de la variedad iceberg se corta por la mitad y se envasa en film comercial F0 y en los Films enviados por el CETEC codificados como F4, F5 y F6. En la tabla 1 y gráfica 1 se pueden observar los resultados obtenidos durante los 21 días de almacenamiento a 4ºC. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 40 ET1BIOFRE Tabla 9: Evolución del pH en lechugas Iceberg Figura 9: Evolución del pH de lechuga Iceberg p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 4 1 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

49. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 48 ET1BIOFRE Tabla 22: Evolución de la textura en las manzanas troceadas, gramos Manzana Con respecto a la evolución de la textura de las manzanas troceadas no se observan cambios significativos en ninguna de las muestras envasadas en los distintos films durante los 21 días de almacenamiento a 4ºC, tal como muestra la Tabla 22. Tabla 23: Evolución de la textura en las manzanas enteras, gramos Tabla 24: Evolución de la textura en tomates, gramos En la tabla 15 se muestran los resultados de manzana entera envasada en los films f0, f4, f5, f6, f8 y f9. Las muestras de manzana envasadas en los films f4, f8 y f9 son las que muestran una mayor pérdida de textura a los 21 días de almacenamiento. Tomate Para el caso de la textura, todas las muestras de tomate durante los 21 días de almacenamiento a 4ºC la textura va descendiendo de manera similar en todos los films utilizados, excepto en los films f8 y f9 que se mantiene, tal como refleja la Tabla 24. p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 4 9 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

50. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 49 ET1BIOFRE Figura 15: . Evolución de la textura en plátano Plátano Con respecto al parámetro textura, el material del film en el que se envasan las muestras de plátano, se observa en la muestra envasado en el film f0, f4 y f9 una mayor disminución de la textura en comparación con las muestras envasadas en los films f5, f6 y f8, tal como se aprecia en Figura 15 6.1.4. Determinación del color Lechuga Se analizan los valores obtenidos para el parámetro L, que indica que la luminosidad de las muestras de lechuga disminuye con el tiempo de almacenamiento de manera similar en todos los films, siendo esta disminución más acusada a partir del día 14 de almacenamiento. los resultados se muestran en la Tabla 25. Tabla 25: Evolución del parámetro de color “L” en lechugas Iceberg p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 5 0 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

61. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 60 ET1BIOFRE respecto a los convencionales en el envasado de determinadas frutas por el tema de su maduración. El aspecto de algunas de las frutas utilizadas en las pruebas dan pie a pensar en una mejor evacuación del etileno por parte de los films biodegradables. 10. Por último, los films biodegradables y sus posibles combinaciones con otros films o aditivos pueden ser una alternativa razonable y necesaria a los films convencionales basados en poliolefinas provenientes de fuentes no renovables. La diferencia de precio de estos nuevos materiales con respecto a los materiales tradicionales es cada vez menor y sus propiedades y comportamiento en máquinas cada día son más parecidos. De aquí a un par de años se espera que la producción de estos materiales biodegradables se multiplique por siete en campo del envase y embalaje de alimentos. 8. BIBLIOGRAFÍA • Artés, F.; Artés-Hernández., F. 2000. Fundamentos y diseño de instalaciones para procesado en fresco de hortalizas. Aliment. Equip. Tecnol. 3, 135-145. • Ayhan, Z., 2011. Effect of packaging on the quality and shelf life of minimally processed ready to eat. Academic Food Journal, pp. 36-41 • Catalá, R., Hernández, P., Lopez, G. & Gavara, R., 2009. Materiales para el envasado de frutas y hortalizas con tratamientos mínimos. Horticultura Internacional, pp. 60-65 • Corbo, M.R.; Altieri, C.; D ́Amato, D.; Campaniello, D.; Del Nobile, M.A.; Sinigaglia, M. 2006. Effect of temperature on shelf life and microbiobial population of lightly processed cactus pear fruit. Postharvest Biol. Tec. 31, 93-104. • FAO, 2011. Appropriate food packaging solutions for developing countries, Düsseldorf: International Congress INTERPACK. • https://www.european-bioplastics.org/ • Kader, A.A, 2002. Quality of fresh-cut fruit and vegetable products. En: Fresh-cut fruit and vegetables. Science, Tecnology and market. O., Lamikanra (Ed). Boca Ratón: CRC Press. 11-28. • Kader, A.A.; Zagory, D.; Kerbel, D.L. 1989. Modified atmosphere packaging of fruits and vegetables. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 28, 1-30 p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 6 1 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 2 0

21. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 20 ET1BIOFRE 4.4.2.2. Proteinas Las proteínas son los componentes estructurales y funcionales de las células vegetales y animales formadas por aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Las proteínas de origen vegetal y animal han sido ampliamente citadas para la preparación de films. Las proteínas vegetales comúnmente utilizadas son la proteína de soja, el gluten de trigo, la zeína de maíz y la proteína de suero, mientras que la gelatina, el colágeno y la queratina son las proteínas animales más estudiadas para la fabricación de films. Sin embargo, las consideraciones relacionadas con la alergia a los alimentos, la intolerancia al gluten de trigo (enfermedad celíaca), la intolerancia a las proteínas de la leche y las creencias o prohibiciones religiosas deben tenerse en cuenta cuando se utilizan películas a base de proteínas para el envasado de alimentos. Se han hecho estudios de films a base de gluten de trigo 35 , los cuales extendieron la vida útil de la fresa refrigerada a 12 días a 7-10 ° C. Los autores también concluyeron que el film de gluten era más prometedor para controlar la descomposición que los recubrimientos a base de gluten. En un estudio diferente, se propusieron películas de zeína plastificadas con ácido oleico para extender la vida útil del brócoli 36 . Las flores frescas de brócoli conservaron su firmeza y color originales después de 6 días de almacenamiento a baja temperatura cuando se envasaron en frascos de vidrio sellados con films de zeína. Se prepararon films compuestos a partir de proteína de salvado de cebada y gelatina que contenían extracto de semilla de pomelo. La incorporación de 0.5% de extracto de semilla de uva en estos films, disminuyó la resistencia a la tracción de 38.17 ± 3.25 a 31.41 ± 0.08 MPa en comparación con el film sin extracto de semilla 37 . Sin embargo, después de 15 días de almacenamiento, las poblaciones de E. coli O157: H7 y L. monocytogenes inoculadas en salmón envasado con el film activo anterior disminuyeron en comparación con el film de control sin extracto de semilla de pomelo. Hay pocos informes disponibles sobre films basados en proteínas que se hayan utilizado para envasar productos agrícolas frescos. La investigación futura puede centrarse en films de proteína para productos recién cortados debido a sus excelentes propiedades mecánicas y de barrera. 35 Tanada-Palmu PS, Grosso CR (2005) Effect of edible wheat gluten-based films and coatings on refrigerated strawberry (Fragari a ananassa) quality. Postharvest Biol Technol 36(2):199-208 36 Takala PN, Vu KD, Salmieri S, Khan RA, Lacroix M (2013) Antibacterial effect of biodegradable active packaging on the growth of Escherichia coli, Salmonella typhimurium and Listeria monocytogenes in fresh broccoli stored at 4 C. LWT Food Sci Technol 53:49 9-506 37 Song HY, Shin YJ, Song KB (2012) Preparation of a barley bran protein-gelatin composite film containing grapefruit seed extr act and its application in salmon packaging. J Food Eng 113(4):541-547 p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 2 1 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

51. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 50 ET1BIOFRE En relación a la evolución del parámetro “L” en la lechuga romana sin trocear, no se observa variación significativa, tal como se describe en los datos de la Tabla 26. Tabla 26: Evolución del parámetro de color “L” en lechugas romana En relación al parámetro a/b no se observa variación significativa en ninguna de las muestras durante los 21 días de almacenamiento, tal como se muestra en la Tabla 27, para lechugas iceberg Tabla 27: . Evolución del parámetro de color “a/b” en lechugas Iceberg Con respecto a la variación del parámetro a/b de las lechugas romanas se observa que las lechugas envasadas en los plásticos f4, f5 y f6 aparece mayor coloración que las envasadas en las films f0, f8 y f9 (Figura 16). Figura 16: Evolución del color “a/b” en lechugas romana p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 5 1 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

52. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 51 ET1BIOFRE En la Tabla 28, se muestran imágenes de las muestras en los distintos días de almacenamiento. Tabla 28: Imágenes de las lechugas Iceberg y lechuga romana Tal como se observa en la tabla 20, a partir del día 14 es cuando se observan cambios en la lechuga iceberg, siendo las muestras almacenadas en los films f5 y f6 los que mantienen mejor la apariencia de la lechuga iceberg y la f4 la peor. Con respecto a la lechuga romana, la almacenada en el film f0 es la que presenta peor apariencia con diferencia de las envasadas en los films f5, f6 y f9. Manzana Tal como se muestra en la Tabla 29 y la Tabla 30, las muestras de manzanas envasadas en films f0, f4, f5 y f6, no presentan variación significativa en relación al parámetro de color “L” y “a/b . Tabla 29: Evolución del parámetro de color “L” en manzanas troceadas p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 5 2 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

43. Las muestras de manzana en los films f0, f4 y f5 no muestran variación significativa del pH durante los 21 días de almacenamiento, sin embargo, las muestras de manzana envasadas en el film f6 muestran un descenso significativo a partir de los 14 días de conservación. Se repite el ensayo de las muestras de manzana en los films f4, f5 y f6 utilizando manzanas sin trocear. Los resultados de la Tabla 12, muestran la evolución en el valor de pH de muestras de manzana sin trocear en los films f0, f4, f5, f6, f8 y f9. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 42 ET1BIOFRE Tabla 12: Evolución del pH en manzana entera No se observa variación significativa del pH durante el almacenamiento de manzana entera en ninguno de los films durante los 21 días de almacenamiento a 4 ° C. Tomate En el caso de los tomates envasados en los distintos films f0, f4, f5, f6, f8 y f9 no se observan variaciones en el pH durante los 21 días de almacenamiento, en ninguna de las muestras. Los valores obtenidos se muestran en la Tabla 13. Tabla 13: Evolución del pH en tomate p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 4 3 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

48. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 47 ET1BIOFRE Figura 14: Evolución del peso de las bolsas de plátano Esto puede deberse a que estos plásticos presentan una mayor permeabilidad al etileno que produce el plátano durante su maduración. 6.1.3. Determinación de la textura Lechuga Con respecto a la textura de las lechugas iceberg, no se observa una variación significativa durante los 21 días de almacenamiento, de acuerdo a los datos de la Tabla 20. Tabla 20: Evolución de la textura en lechugas Iceberg, gramos Lo mismo ocurre con las muestras de lechuga romana, tal como se aprecia en la Tabla 21. Tabla 21: Evolución de la textura en lechugas romana, gramos p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 4 8 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

3. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 02 ET1BIOFRE CONTENIDO 1. INTRODUCCIÓN 03 2. OBJETIVOS 04 2.1. Objetivos generales 04 2.2. Objetivos específicos 05 3. CRONOGRAMA 05 4. ANTECEDENTES 07 4.1. Frutas y hortalizas frescas y de IV gama. 07 4.2. Envasado de productos frescos y mínimamente procesados 10 4.3. Materiales usados en el envasado de frutas y hortalizas frescas y mínimamente procesadas. Problemática: 11 4.4. Estado del arte de materiales procedentes de fuentes renovables para el envasado de alimentos 12 4.4.1. Importancia de los envases en frutas y verduras recién cortadas 14 4.4.2. Fuentes de polímeros biodegradables 15 5. MATERIALES Y MÉTODOS 22 5.1. Materias primas 24 5.2. Materiales plásticos. 25 5.3. Metodología de trabajo 31 5.4. Análisis fisicoquímicos 35 5.5. Análisis microbiológicos 36 5.6. Análisis estadísticos 39 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 40 6.1. Análisis físico-químicos 40 6.1.1. Determinación del pH 40 6.1.2. Determinación del peso 43 6.1.3. Determinación de la textura 47 6.1.4. Determinación del color 49 6.2. Análisis microbiológicos 57 7. CONCLUSIONES 59 8. BIBLIOGRAFÍA 60 p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 3 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

38. caseína, 2,5g/L de extracto de levadura, 1,0g/L D (+) glucosa y 14g/L de agar-agar. Tras ello, se mezclan perfectamente en la placa el medio y el inóculo, con movimientos circulares a favor y en contra de las agujas del reloj, evitando que el medio de cultivo impregne la tapa, manteniendo las placas en superficie horizontal hasta que se solidifique el agar completamente. Una vez solidificado el agar, se invierten las placas e introducen en la estufa evitando que se apilen en exceso, incubando a 30 ºC durante 48 horas. Tras el periodo de incubación, se cuentan las placas entre 30 y 300 colonias, marcando las mismas para evitar volver a contarlas. A continuación, se halla la media y se multiplica por el factor de la dilución, expresando los resultados en unidades formadoras de colonias por gramo (Pascual y Calderón, 2000). Enterobacterias Totales Se siguió el procedimiento basado en ISO 21528-2:2004, UNE-EN ISO 7218 y UNE-EN ISO 7218:2008/A1 basados en el recuento total de las bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae presentes en alimentos, mediante el aislamiento e identificación con medio VRBG agar y posterior confirmación de las colonias características. Los microorganismos de esta familia son de forma bacilar, gram negativos, fermentadores de glucosa, oxidasa negativa y crecen en medios con sales biliares, formando colonias características en el medio VRBG agar. Se prepara el medio de cultivo VRBG Agar, siguiendo las instrucciones de la casa suministradora y se prepara una suspensión inicial de la muestra de manera que se obtenga una distribución, tan homogénea como sea posible, de los microorganismos presentes en la fracción de ensayo Una vez realizada la preparación de la muestra y las diluciones decimales necesarias se siembra sobre placas Petri 1ml ± 2% de la muestra a analizar (si es líquida) o 1 ml ± 2% de la dilución inicial o madre (1/10) para el resto de productos. Si se sospecha que la muestra presenta una concentración elevada de Enterobacterias, se siembra 1ml ± 2% de las diluciones decimales superiores utilizando una nueva pipeta estéril para cada dilución. Se realiza la siembra de una sola placa por dilución para un mínimo de dos diluciones consecutivas. Añadir, a cada placa sembrada, aproximadamente 10 ml de medio de cultivo VRBG previamente preparado y atemperado entre 44º C y 47º C en baño de agua. El tiempo máximo, entre la distribución del inóculo en las placas y verter el medio de cultivo en las mismas, no debe exceder de 15 minutos. Mezclar perfectamente medio e inóculo con suave agitación para evitar derrames y un movimiento circular a favor y en contra de las agujas de reloj. Dejar solidificar el medio sobre una superficie horizontal, y cuando este sólido se cubre con una capa de Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 37 ET1BIOFRE p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 3 8 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

58. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 57 ET1BIOFRE Las muestras de plátano almacenadas en el film f4 empiezan a oscurecer a partir del día 14, sin embargo, las muestras de plátano envasadas en los films f5 y f8 son las que presentan peor apariencia a los 21 días de almacenamiento. La muestras envasadas en los films f6 y f9 son las que mantienen mejor la apariencia. 6.2. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS Lechuga A las muestras de lechuga iceberg almacenadas en refrigeración se les realiza un seguimiento de los recuentos de aerobios mesófilos, mohos y levaduras y Eschirichia Coli. Los recuentos de mohos y levaduras y Eschirichia Coli han sido <10 ufc/mL en todas las muestras de films y durante los 21 días de almacenamiento. Sin embargo, en el caso de los recuentos de los aerobios mesófilos, ya muestra unos niveles de > 3*106 a partir de los 7 días de almacenamiento. Esto se debe a la manipulación del producto a la hora de realizar el corte. Por lo que las siguientes muestras se envasan enteras. Los resultados microbiológicos de las muestras de lechuga romana envasadas en los films f0, f4, f5, f6 f8 y f9, muestran recuentos de aerobios mesófilos a partir del día 7 de almacenamiento y no hay crecimiento de mohos y levaduras y Eschirichia Coli, por lo que el film en este caso no influye en el crecimiento microbiano de las lechugas variedad romana. Manzana Los recuentos de mohos y levaduras y Eschirichia Coli han sido <10 ufc/mL en todas las muestras de films y durante los 21 días de almacenamiento tanto para las manzanas troceadas como para las manzanas enteras. Sin embargo, en el caso de los recuentos de los aerobios mesófilos desde el día 7 de almacenamiento, se observan los recuentos reflejados en la Tabla 37. Tabla 37: Recuento de aeróbios mesófilos en manzanas troceadas, ufc/mL En el caso de los films f5 y f6 a partir de los 14 días de almacenamiento ya se observan recuentos muy elevados de microorganismos aerobios mesófilos y en el caso de las muestras de manzana troceadas envasadas en films f0 y f4 a partir de 21 días de almacenamiento. En la Tabla 38 se muestran los resultados de los análisis microbiológicos en manzanas sin trocear en todos los tipos de films ensayados. p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 5 8 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 2 0

59. Tabla 38: Recuento de aeróbios mesófilos en manzanas enteras, ufc/mL Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 58 ET1BIOFRE La entrada de aire en las manzanas enteras envasadas en los films f4, f5 y f6 permiten el desarrollo de microorganismos aeróbios mesófilos a partir de los 7 días de almacenamiento. Tomate Con respecto a las muestras de tomate no se han encontrado recuentos de aeróbios mesófilos, mohos y levadura y Eschirichia Coli, durante los 21 días de almacenamiento a 4ºC, en ninguna de las muestras de tomate envasadas en los films f0, f4, f5, f6, f8 y f9. Plátano En relación del recuento de microorganismos , mohos y levaduras y Eschirichia Coli, no se observa desarrollo durante los 21 días de almacenamiento a 4ºC en todos los films utilizados. Sin embargo, se observa crecimiento de microorganismos aerobios mesófilos, tal como muestra la Tabla 39. Tabla 39: Recuento de aeróbios mesófilos en plátanos, ufc/mL Las muestras envasadas en el film f6, f8 y f9 son las que menor recuento de ufc/ml presenta al final de los 21 días de almacenamiento. p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 5 9 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 2 0

39. unos 15 ml de agar VRBG atemperado evitando que se produzca un crecimiento extendido y generando unas condiciones de semi-anaerobiosis. Una vez solidificado el medio, se invierten las placas y se colocan en una estufa donde se incuban a 37 ± 1º C durante 24 ± 2 horas. Pasadas las 24 horas de incubación, se cuentan el número de colonias características por placa con un contador de colonias. Para el recuento se tomarán las placas que presenten un número igual o inferior a 150 colonias típicas y aquellas que presenten un número igual o inferior a 300 colonias totales (colonias típicas y no típicas). Se contarán todas las colonias características de dichas placas. Se consideran colonias características las colonias de color rosa a rojas o púrpuras rodeadas o no de un halo de precipitación rojizo-violeta. Una vez realizado el recuento, se eligen al azar 5 colonias características para subcultivarlas y realizar la confirmación. Ciertas Enterobacterias pueden causar la decoloración de sus colonias o del medio. Por lo tanto, cuando no aparezcan colonias características, se cogen 5 colonias blanquecinas para la confirmación. Sembrar, sobre placas Petri de agar nutritivo o PCA, cada una de las colonias seleccionadas para la confirmación. Incubar estas placas a 37 ± 1º C durante 24 ± 2 horas. Posteriormente, seleccionar colonias aisladas de cada una de las placas incubadas para realizar el test de confirmación. •Test de la oxidasa: Con un asa estéril, se toma una porción de cada una de las colonias aisladas y se deposita sobre un papel de filtro impregnado con el reactivo de la oxidasa o sobre un disco disponible comercialmente. Se considera oxidasa-negativa si el color del papel de filtro no se oscurece en un tiempo de 10 segundos. Para los discos disponibles comercialmente consultar las instrucciones del fabricante. •Test fermentación glucosa: Usando un asa de estéril, se siembran en agar glucosa las mismas colonias seleccionadas que dan la reacción de oxidasa como negativa. Se considera la reacción positiva si se produce un viraje del medio a color amarillo. Las colonias que son oxidasa-negativas y glucosa positivas se confirman como Enterobacterias. El recuento de colonias debe realizarse al menos en una placa que contenga como mínimo 10 colonias (colonias totales, típicas o que cumpla los criterios de identificación). El número de microorganismos N presentes en la muestra para análisis se calcula como la media corregida de dos diluciones consecutivas. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 38 ET1BIOFRE p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 3 9 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

36. Zona de trabajo Todas las pruebas que se han realizado en este proyecto y que requerían contacto directo con los alimentos se han realizado en la sala blanca del CTC con la finalidad de controlar la posible contaminación ambiental de los productos. Esta sala blanca respeta las normativas ISO 14644 con las condiciones de diseño propias de estas zonas de trabajo en cuanto al flujo de personas, materiales, equipos y desechos. Los parámetros ambientales que se deben regular en estas salas son la temperatura, presión, humedad relativa, flujo de aire, iluminación y número de partículas. En concreto la sala ultralimpia del CTC cuenta con una superficie de trabajo de 50 m2, que garantiza el suficiente espacio de trabajo con la maquinaria necesaria; filtros microbiológicos HEPA modelo N-1000 μ m, para controlar el tamaño y número de las partículas y microorganismos en suspensión, equipo de ventilación que garantiza la correcta renovación del aire de la sala con la frecuencia necesaria; presurizada con presión positiva con el objetivo de impedir la entrada de aire desde el exterior; la temperatura constante a 4ºC, para mantener unas buenas condiciones de conservación de los alimentos; el flujo de aire, iluminación y la humedad también son constantes y acordes a los valores críticos para este tipo de sala. 5.4. ANÁLISIS FISICOQUÍMICOS Determinación del pH El valor de pH se determinó por lectura directa, introduciendo el electrodo combinado del pH-metro Crison basic 20 (Barcelona, España) de acuerdo con el método descrito para análisis de acidez en alimentos (Ministerio de Sanidad y Consumo, 1985). Para ello, se homogenizan 10g de muestra en 50 mL de agua destilada al 20% (w/v). Antes de cada lectura, se calibra el aparato con las soluciones tampón de pH 7 y pH 4 de Crison (Barcelona, España). Determinación del peso Cada 7 días se controla el peso de la bolsa a analizar para comprobar la permeabilidad y estanqueidad del temosellado del film. Se utiliza un abalanza Sartorious de laboratorio modelo TE6101 con una capacidad máxima de 1500 gramos y precisión de 0,01 gramos. Determinación de la textura Se utilizó un Texturometro TA.XT2i TEXTURE ANALYSER (Texture Technologies Corporation, USA), equipado con una sonda HDP/BS para determinar el punto de máxima fuerza de compresión de la cuchilla en las mitades de alcachofa. Consta de una cuchilla Warner Bratzler, una cuchilla reversible, una zona de inserción para la cuchilla y un sustentador de la misma. La cuchilla reversible tiene un borde afilado en un extremo y un borde de guillotina plano en el otro. Durante el proceso de medida, la cuchilla está firmemente sujeta por medio del sustentador, el cual está enroscado directamente al Texturómetro. La ranura de inserción se Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 35 ET1BIOFRE p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 3 6 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

32. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 31 ET1BIOFRE 5.3. METODOLOGÍA DE TRABAJO La materia prima es adquirida en un mayorista de frutas y hortalizas el mismo día del envasado, el proceso seguido para cada uno de los productos se muestra en la Figura 4. Figura 4: Diagrama de flujo del procesado de tomate, lechuga, plátano y manzana Dependiendo del alimento a procesar las distintas fases del proceso son distintas: • El CTC recibe de CETEC los biofilms en rollos continuos por lo que se procede a la fabricación de las bolsas mediante termosellado. Las dimensiones de las bolsas son de 46x20 cm y las condiciones de termosellado fueron las siguientes: • Film F0: 160 ° C durante 5 segundos • Film F4: 160 ° C durante 3 segundos • Film F5: 100 ° C durante 3 segundos • Film F6: 160 ° C durante 3 segundos • Film F8: 100 ° C durante 3 segundos • Film F9: 160 ° C durante 3 segundos p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 3 2 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

20. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 19 ET1BIOFRE extractos de ginseng para aplicaciones de envasado 27 . así, la permeabilidad al vapor de agua del film de alginato puro fue 1.72 ± 0.07x10 _7 gxm _2 xdíaxPa y la resistencia a la tracción fue 22.2 ± 4 MPa; con la adición de extracto de ginseng, cambió a 2.28 ± 0.13x10 _7 gxm _2 xdíaxPa y 10.76 ± 1.77 MPa, respectivamente. El aumento observado en la permeabilidad fue insignificante, por lo que la incorporación del extracto de ginseng no afecta las propiedades barrera del film de alginato. También se desarrollaron films utilizando metilcelulosa, policaprolactona y alginato junto con agentes antimicrobianos que incluyen ácido acético, extracto de romero y aceite esencial de especias asiáticas 28 . El film obtenido controló de manera efectiva el crecimiento de L. monocytogenes y E. coli durante los primeros 4 días y el crecimiento de Salmonella typhimurium durante 12 días en brócoli fresco almacenado a 4 ° C. 4.4.2.1.5. Ácido poliláctico El ácido poliláctico (PLA) es un poliéster alifático termoplástico derivado de material renovable como el maíz, las raíces de tapioca o la caña de azúcar. El PLA está clasificado como GRAS (generalmente reconocido como seguro) por la FDA y autorizado por la Comisión Europea para usarse en contacto con alimentos, por estas razones, es un material excelente para fabricar envases biodegradables. Por ejemplo, se han desarrollado nuevos sistemas de envasado de alimentos utilizando PLA que contiene extracto de Allium spp. para ensaladas listas para comer 29 . Dichos films mostraron que eran efectivos hasta 5 días para el almacenamiento de ensaladas a 4 ° C. Los films basados solamente en PLA también se usan para extender la vida útil de varios productos agrícolas, incluidos los arándanos 30 , el apio 31 , las espinacas 32 y el melón 33 . 4.4.2.1.6.Policaprolactona La policaprolactona (PCL) es un tipo de poliéster biodegradable, preparado mediante la polimerización por apertura de anillo de E-caprolactona. Se ha estudiado un laminado pegando una película de quitosano- celulosa a una película de PCL y se ha obtenido una lámina biodegrable adecuado para el envasado y almacenamiento de repollo, brócoli, tomates, maíz dulce y arándanos 34 . 29 Llana-Ruiz-Cabello M, Pichardo S, Baños A, Núñez C, Bermúdez JM, Guillamón E, Aucejo S, Cameán AM (2015) Characterisation an d evaluation of PLA films containing an extract of Allium spp. to be used in the packaging of ready-to-eat salads under controlle d atmospheres. LWT Food Sci Technol 64(2):1354-1361 30 Almenar E, Samsudin H, al AR (2008) Postharvest shelf life extension of blueberries using a biodegradable package. Food Chem 110:120-127 31 González-Buesa J, Page N, Kaminski C, Ryser ET, Beaudry R, Almenar E (2014) Effect of non-conventional atmospheres and bio-b ased packaging on the quality and safety of Listeria monocytogenes-inoculated fresh-cut celery (Apium graveolens L.) 32 Botondi R, Bartoloni S, Baccelloni S, Mencarelli F (2015) Biodegradable PLA (polylactic acid) hinged trays keep quality of f resh-cut and cooked spinach. J Food Sci Tech 52:5938-5945 33 Huijuan ZH, Kawamura S, Koseki S et al (2016) Comparative quality changes of fresh-cut melon in bio-based and petroleum base d plastic containers during storage. Environ Contr Biol 54:93-99 34 Makino Y, Hirata T (1997) Modified atmosphere packaging of fresh produce with a biodegradable laminate of chitosan-cellulose and polycaprolactone. Postharvest Biol Technol 10:247-254 p r o y e c t o E T 1 B I O F R E . p d f 2 0 2 0 / 0 9 / 2 0 2 0 : 1 9

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