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1. Desarrollo de nuevas tecnologías para la producción de bioplástico PHA a partir de residuos agroalimentarios de la Región de Murcia. Modalidad 1: Proyecto I+D Independiente Alhama de Murcia 2019-2020 Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa BIO PLASMUR

60. Desarrollo de nuevas tecnologías para la producción de bioplástico PHA a partir de residuos agroalimentarios de la Región de Murcia. Modalidad 1: Proyecto I+D Independiente Alhama de Murcia 2019-2020 Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa BIO PLASMUR

11. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 10 Altamirano León, L. M., & Ramos Romero, E. (2018). Rendimiento de polihidroxialcanoatos producidos por bacterias fijadoras de nitrógeno aisladas de Asparagus officinalis L., noviembre-diciembre, 2016: Esta investigación tiene como objetivo la producción de PHA con bacterias fijadoras de nitrógeno (Asparagus officinalis L.) obtenidas de muestras naturales. Se realizó la tinción negro Sudán y se compraron los rendimientos obtenidos para determinar que las bacterias fijadoras de nitrógeno, aisladas del espárrago, producían PHA. Cruz, Madalena V, Alexandre Paiva, Pedro Lisboa, Filomena Freitas, Pedro Simões, Susana Barreiros, y Maria A. M. Reis. 2014. «CEER - Biosystems Engineering Center , Instit ute of Agronomy , University of Lisbon , 1349- 017». BIORESOURCE TECHNOLOGY: En esta investigación se genera PHA a partir de aceite de café molido, empleando Cupriavidus necator. El polímero se analizó y caracterizó con el fin de obtener sus cualidades como material plástico. Han, Jing, Jing Hou, Hailong Liu, Shuangfeng Cai, Bo Feng, Jian Zhou, y Hua Xiang. 2010. «Wide distribution among halophilic archaea of a novel polyhydroxyalkanoate synthase subtype with homology to bacterial type III synthases». Applied and Environmental Microbiology 76(23):7811-19: Se estudiaron 28 cepas de las cuales solamente 18 eran productoras de PHA. Además, se realizó un estudio genético de los genes phaE y phaC que codifican a una PHA sintasa tipo III. Esta también se estudió filogenéticamente en los dominios de Halobacteriaceae y Bacteria. Quillaguamán, J., Guzmán, H., Van-Thuoc, D., & Hatti-Kaul, R. (2010). Synthesis and production of polyhydroxyalkanoates by halophiles: current potential and future prospects. Applied microbiology and biotechnology, 85(6), 1687-1696: Realiza un repaso biobibliográfico de distintos microorganismos como Echerichia coli, Alcaligenes latus, Halomonas boliviensis o Haloferax mediterranei desde la fuente de carbono, síntesis de PHA, ... También se realiza un estudio genético filogenético y de los genes implicados, PHA polimerasa. Mohammed, Seid, Ananta N. Panda, y Lopamudra Ray. 2019. «An inve stigation for recovery of polyhydroxyalkanoates (PHA)from Bacillus sp. BPPI-14 and Bacillus sp. BPPI-19 isolated from plastic waste landfill». International Journal of Biological Macromolecules 134:1085-96: En este artículo realizan la producción de PHA con dos cepas de Bacillus sp., empleando glucosa y melaza como fuente de carbono. Además, se realizaron las tinciones negro Sudán y azul Nilo como prueba cualitativa de la presencia de los gránulos. Además, se caracterizó el PHA obtenido con FT-IR. Shamala, T. R., Chandrashekar, A., Vijayendra, S. V. N., y Kshama, L. (2003). Identification of polyhydroxyalkanoate (PHA)_producing Bacillus spp. using the polymerase chain reaction (PCR). Journal of Applied Microbiology, 94(3), 369-374: El objetivo de este documento es la creación de especies de Bacillus productoras de PHA aislados de bacterias de suelo. Se realizó identificación mediante aislamientos y la caracterización del PHA producido en cepas positivas en una prueba de PCR.

32. En relación con las condiciones bajo las cuales ocurre la síntesis de los PHA, de manera general las bacterias usadas para la producción de PHA pueden ser divididas en dos grupos, según las condiciones de cultivo que requieren para la síntesis del polímero. El primer grupo de bacterias requiere de la limitación de un nutriente esencial (nitrógeno, fósforo, azufre, magnesio, oxígeno) , para sintetizar PHA a partir de un exceso de fuente de carbono. Este grupo incluye a Ralstonia eutropha, Pseudomonas extorquens y Pseudomonas oleovorans (Tabla 8). El segundo grupo de bacterias no requiere de la limitación de nutrientes para la síntesis de PHA y pueden acumular polímero en grandes cantidades durante la fase de crecimiento. Este grupo incluye a Alcaligenes latus, Azotobacter vinelandii recombinante y E. coli recombinante, entre otras, que acumulan grandes cantidades de polímero durante la fase de crecimiento exponencial (> 50 %), a diferencia del otro grupo de bacterias que durante esta fase acumulan muy bajas cantidades de polímero. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 31 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución

35. La dificultad que se plantea actualmente es encontrar microorganismos productores de las variantesquímicas idóneas de PHAs y que además sean capaces de crecer de forma óptima y con altosrendimientos en formulaciones de medios de cultivos preparadas con residuos de industrias. Algunos de estos residuos industriales pueden contener presencia de sustancias químicas que pueden resultartóxicos para muchos microorganismos o presentar características físico-químicas (pH, salinidad, etc) que puede interferir con el crecimiento y/o viabilidad de los microorganismos. Además, el rendimiento de la fermentación se ve afectado por la temperatura, pH, radio de alimentación de carbono/nitrógeno, la concentración de sustratos, la concentración de elementos trazas, la concentración de iones, la intensidad de agitación y el oxígeno disuelto entre los principales factores. Lamayoría de microorganismos utilizados en los procesos industriales de producción de PHAs son bacterias con un crecimiento óptimo a 37ºC y muy susceptibles a los cambios de temperatura, pH y oxígeno, pues la mayoría son aerobias estrictas. El uso de microorganismos productores de PHAs que resistan bien cambios de los parámetros de fermentación, en los cuales las fluctuaciones de pH, temperatura, niveles de oxígeno disuelto no sean factores críticos para la supervivencia del microorganismo puede aumentar el rendimiento de conversión de sustrato a PHA, y disminuir los costos inherentes a ellos. Es por ello que microorganismos productores del copolímero PHBHV que además presenten unas capacidades metabólicas que les permitan desarrollarse en condiciones óptimas en presencia de sustancias que son no bioasimilables o con condiciones extremas en términos de pH, salinidad, etc serían unos candidatos idóneos. Estos candidatos los podemos encontrar dentro de los microorganismos extremófilos. Se han seleccionado como microorganismos a utilizar en el desarrollo del método de producción piloto de PHBVB, un tipo de microorganimos extremófilos, los organismos halófilos. La selección de estos organismos se ha realizado de acuerdo a las siguientes ventajas que presentan frente a otros microorganismos usados en producción de PHAs: 1. Son organismos altamente resistentes a las condiciones ambientales, por lo que presentan crecimientos adecuados de biomasa sin necesidad de controles muy exhaustivos de los parámetros de proceso como temperatura, oxígeno disuelto o valores de pH. Se alcanzan altos rendimientos de conversión del sustrato a PHAs al emplear microorganismos resistentes a parámetros fluctuantes durante la fermentación (pH, oxigenación y temperatura). 2. Crecen en medios salinos, por lo que se pueden producir en ausencia de agua dulce, aprovechando la abundancia de agua salada de la Región de Murcia e instalaciones como desaladoras o salinas. 3. Al crecer en medios altamente salinos, son difícilmente contaminables por otros microorganismos, por lo que no se requiere de procesos de asepsia y esterilización , se evita así una etapa del proceso de alto consumo energético. 4. Microorganismos productores de copolímeros de PHBHV, incluso sin presencia de precursores directos de 3HV. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 34 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución

5. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 04 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución «Polyhydroxyalkanoate (PHA) biosynthesis from whey lactose». Macromolecular Symposia 272(1):87-92: En este estudio se compara la capacidad productora de PHA, la estabilidad y robustez de tres cepas salvajes de Haloferax mediterranei, Pseudomonas hydrogenovora e Hydrogenophaga pseudoflava. H. mediterranei consiguió llegar al 50% en peso sin adicionar ningún precursor, mientras que P. hydrogenovora llegó al 12% y H. pseudoflava alcanzó un 40% en peso utilizando ácido valéric o como precursor. Keshavarz, Tajalli y Ipsita Roy. 2010. «Polyhydroxyalkanoates: bioplastics with a green agenda». Current Opinion in Microbiology 13(3):321-26: En esta revisión bibliográfica se trata de la producción, aislamiento, purificación y mejora de las propiedades de los PHA. También de los organismos productores y de sus aplicaciones para sustituir a los plásticos de origen petroquímico. Mangaraj, S., Ajay Yadav, Lalit M. Bal, S. K. Dash, y Naveen K. Mahanti. 2019. «Application of Biodegradable Polymers in Food Packaging Industry: A Comprehensive Review». Journal of Packaging Technology and Research 3(1):77-96: En este artículo se estudia el uso de bioplásticos como almidón, PLA, PHA y diferentes mezclas frente a los plásticos tradicionales de origen petroquímico para MAP y otras aplicaciones de envasado. Además, se evalúa sus vías metabólicas de síntesis, propiedades, biodegradación, etc. Respecto a polímero en sí se ha utilizado Noda et al., 1999 como base para el resto de la bibliografía empleada, ya que es un libro de referencia. Bugnicourt et al., 2014, Farris et al., 2014, Foreman, Gill, y Sauerbrunn, s. f. y Laycock et al., 2014 aportan información más reciente sobre las propiedades de este polímero. Farris, Giuseppe, Patrizia Cinelli, Irene Anguillesi, Sara Salvadori, Maria Beatrice Coltelli, y Andrea Lazzeri. 2014. «Effect of ageing time on mechanical properties of plasticized poly(hydroxybutyrate) (PHB)». AIP Conference Proceedings 1599:294-97: En este estudio se evalúan las propiedades de materiales basados en PHB preparados con plastificantes. Se estudiaron la estabilidad, el módulo elástico y la resistencia a la tracción. Al final se establece una correlación entre la estructura y la concentración de los diferentes plastificantes. Foreman, Jonathon, Philip S. Gill, y Steven R. Sauerbrunn. s. f. «Tensile Modulus of Plastic Films *». Polymer: En este artículo se caracteriza el comportamiento de las películas de plástico bajo tensión y deformación por tracción. Laycock, Bronwyn, Peter Halley, Steven Pratt, Alan Werker, y Paul Lant. 2014. «The chemomechanical properties of microbial polyhydroxyalkanoates». Progress in Polymer Science 39(2):397-442: Se trata de un estudio de la estabilidad del PHA y cómo varían sus propiedades de tracción en función del tiempo de envejecimiento. Noda I., Marchessault R. H., Terada M.: Polymer data handbook. Oxford University Press, London (1999): En esta enciclopedia se recopilan todos los polímeros conocidos. Trata de su clasificación, estructuras, aplicaciones principales, propiedades principales y características generales.

6. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 05 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Finalmente, en este bloque sobre los PHA se ha consultado los intereses que estos presentan, sobre todo sus posibles aplicaciones. Estos documentos le dan la relevancia a este polímero. Estos documentos son lo que se mencionan a continuación Han et al., 2015, Kalia et al., 2019, Niaounakis, 2015, Mangaraj et al., 2019 y van den Oever et al., 2017. Han, Jing, Lin-ping Wu, Jing Hou, Dahe Zhao, y Hua Xiang. 2015. «Biosynthesis, Characterization, and Hemostasis Potential of Tailor- Made Poly(3-hydroxybutyrate- co -3-hydroxyvalerate) Produced by Haloferax mediterranei»: Realizan una biosíntesis de PHA, concretamente RPHBV o copolímeros de orden superior a base de glucosa y 3HV. Se caracteriza la estructura microquímica. el peso molecular y la distribución empleando RMN, GPC, DSC y TGA. Además, se comprobó la capacidad de hemostasia en aplicaciones de curación. Kalia, Vipin Chandra, Subhasree Ray, Sanjay K. S. Patel, Mamtesh Singh, y Gajendra Pratap Singh. 2019. «The dawn of novel biotechnological applications of polyhydroxyalkanoates». Biotechnological Applications of Polyhydroxyalkanoates 1-11: En este artículo se tratan las diferentes aplicaciones que tienen los PHA. Destaca su valor en medicina porque son un producto de alto valor, biocompatible, biodegradable y no son tóxicos. Niaounakis, M. (2015). Biopolymers: applications and trends. William Andrew: En este libro se habla sobre los biopolímeros existentes, sus clasificaciones, definición, propiedades, biodegradabilidad, tipos y química de estos. Además, se realiza hincapié en todas las posibles aplicaciones que estos reciben desde electrónica a deportes y juguetes. Van den Oever, Martien, Karin Molenveld, Maarten van der Zee, y Harrie_tte Bos. 2017. Bio-based and biodegradable plastics: facts and figures: focus on food packaging in the Netherlands: En este documento se hace un estudio del estado del arte de los plásticos biodegradables y/o de los de base biológica cuya aplicación es el embalaje. El siguiente bloque bibliográfico corresponde a H. mediterranei y el análisis experimental realizado. Lillo y Rodríguez-Valera tienen el primer artículo en el que aparece H. mediterranei y cuanto PHA es capaz de acumular. Estas ideas se refuerzan con Koller et al., 2007. Entre estos se crea una base para el resto de los artículos consultados. Koller, Martin, Paula Hesse, Rodolfo Bona, Christoph Kutschera, Aid Atli_, y Gerhart Braunegg. 2007. «Biosynthesis of high quality polyhydroxyalkanoate Co- And terpolyesters for potential medical application by the archaeon Haloferax mediterranei». Pp. 33-39 en Macromolecular Symposia. Vol. 253: En este documento los autores utilizan H. mediterranei para la producción de PHA. Para ello utilizaron suero de azúcar como fuente de carbono y se utilizó 3HV y 4HB como precursores para comparar el producto final obtenido. Además, se elaboró un análisis cinético. Koller, Martin, Paula Hesse, Rodolfo Bona, Christoph Kutschera, y Gerhart Braunegg. 2007. «Potential of Various

7. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 06 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Archae- and Eubacterial Strains as Industrial Polyhydroxyalkanoate Producers from Whey». 218-26: El objetivo es obtener PHA a partir del excedente de suero de leche producción. Para ello se compararon 3 cepas salvajes, de las cuales la cepa de H. mediterranei fue la que me jor resultados dio al tener una mayor estabilidad y robustez. Lillo, Jose Garcia y Francisco Rodriguez-valera. 1990. «Effects of Culture Conditions on Poly ( 3-Hydroxybutyric Acid ) Production by Haloferax mediterranei». 56(8):2517-21: Se estudiaron distintas condiciones de H. mediterranei para distintas temperaturas, pH, concentración de agua de sales y mmol de dioxígeno por litro, empleando glucosa o almidón como fuentes de carbono. Se llegó a alcanzar una producción de 6 g/l de PHA. Para el seguimiento llevado a cabo se ha consultado con Bhattacharyya et al., 2015 que menciona que nuestro microorganismo presenta bacteriorruberina, de modo que, con Flores et al., 2020 se amplía esta información y habla más de este pigmento para determinar la longitud de onda para el control del cultivo. También se consulta Alsafadi y Al-Mashaqbeh, 2017, Ferre-Guell y Winterburn, 2018 y Huang et al., 2006 para saber a qué longitud de onda se mide el crecimiento mayoritariamente en la bibliografía. Alsafadi, Diya y Othman Al-Mashaqbeh. 2017. «A one-stage cultiva tion process for the production of poly- 3-(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) from olive mill wastewater by Haloferax mediterranei». New Biotechnology 34:47-53: En este estudio se realiza una fermentación de H. mediterranei en un único paso y sin la adición de carbono externo para la obtención PHBHV. Se estudió si el agua residual producida en los molinos de oliva sirve como fuente de carbono a pesar de la cantidad de polifenoles que esta presenta. Además, se optimiza el método de Lillo y Rodríguez- Valera para la extracción de los PHAs al no emplear acetona. Bhattacharyya, Anirban, Arnab Pramanik, Sudipta Kumar Maji, Saubhik Haldar, y Ujjal Kumar Mukhopadhyay. 2012. «Utilization of vinasse for production of Haloferax mediterranei». AMB Express 2(1):1: En este trabajo se empleó la vinaza producida en la destilación de etanol para producir PHA con H. mediterranei. Se comparó la vinaza cruda, tras pretratar al 25% de vinaza y a un 50% de vinaza y tras el bioprocesamiento de la vinasa pretatada al 25% y al 50%. También se caracterizaron los PHAs obtenidos. Ferre-Guell, Anna y James Winterburn. 2018. «Biosynthesis and Characterization of Polyhydroxyalkanoates with Controlled Composition and Microstructure». Biomacromolecules 19(3):996-1005: En este artículo emplean H. mediterranei para producir PHBV con ácidos grasos de cadena corta con 3HV. Se comprobó que las propiedades de los copolímeros formados con 3HV eran mejor que sin emplearlo, ya que tenía una temperatura de fusión mejor, mayor elasticidad y ductilidad. Flores, Nataly, Sebastián Hoyos, Mauricio Venegas, Alexandra Galetovi_, Lidia M. Zúñiga, Francisca Fábrega,

8. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 07 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Bernardo Paredes, Camila Salazar-Ardiles, Claudia Vilo, Carmen Ascaso, Jacek Wierzchos, Virginia Souza- Egipsy, Jorge E. Araya, Ramón Alberto Batista-García, y Benito Gómez-Silva. 2020. «Haloterrigena sp. Strain SGH1, a Bacterioruberin-Rich, Perchlorate-Tolerant Halophilic Archaeon Isolated From Halite Microbial Communities, Atacama Desert, Chile». Frontiers in Microbiology 11(March):1-18: El objetivo es producir carotenos con la cepa SGH1, que es un nuevo halófilo aislado. Para ello se probaron distintas condiciones de temperatura y salinidad. Además, se adicionó KCl y casaminoác idos para mejorar el crecimiento. Huang, Ting-yen Huang Æ. Kow-jen Duan Æ. Shih-yow, C. Will Chen, Æ. Starch, y Æ. Repeated. 2006. «Production of polyhydroxyalkanoates from inexpensive extruded rice bran and starch by Haloferax mediterranei». 701-6: Se utilizaron distintos materiales agrícolas (arroz extruido, maíz extruido, salvado de trigo extruido, salvado de arroz y salvado de trigo) para la producción de PHA con H. mediterranei. De todos estos los que mejor resultado dan es una relación (1:8 g/g) de arroz extruido y almidón de maíz extruido obteniendo 140 g/l de biomasa y 77,8 g/l de PHA. Se llega a la conclusión de que en condiciones hipersalinas y sin limitación de nitrógeno se puede realizar a gran escala en modo continuo. Las características del cultivo las hemos obtenido con Lillo y R odriguez-Valera, 1990. Estas se han ampliado y concretado en Alsafadi y Al-Mashaqbeh, 2017, Ferre y James, Huang et al., 2006, 2017 y Nájera-Fernández et al., 2012. Además, con Ferre-Guell, Legat et al.,2010 y Winterburn, 2018 se aprecian las necesidades de H. mediterranei para su cultivo. Asimismo, se han estudiado otras investigaciones que han utilizado sustratos no tradicionales Bhattacharyya et al., 2015, Ghosh et al., 2019, Hermann-Krauss et al., 2013 y Liu et al., 2015. Esto muestra que H. mediterranei presenta una gran versatilidad metabólica e indicando que sería capaz de emplear nuestro sustrato como fuente de alimentación para la síntesis. En estos documentos han servido para la creación de los medios empleados en el análisis experimental. Bhattacharyya, Anirban, Kuntal Jana, Saubhik Haldar, Asit Bhowmic, Ujjal Kumar Mukhopadhyay, Sudipta De, y Joydeep Mukherjee. 2015. «Integration of poly-3-(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) production by Haloferax mediterranei through utilization of stillage from rice-based ethanol manufacture in India and its techno-economic analysis». World Journal of Microbiology and Biotechnology 31(5):717-27: En este trabajo se estudió acoplar la producción de PHBV con H. mediterranei con la destilación de alcohol (etanol) a partir de melazas de arroz. Las células han llegado a alcanzar una concentración de 63% de PHA en biomasa y unos 13,12 g de PHA por litro. También se estudia la desalinización del medio, una vez terminado el cultivo y cuánto costaría la producción (2,05 $ US /kg) para evaluar su vialidad escalando. Ferre, Anna y Guell James. 2017. «Production of the copolymer poly (3 hydroxybutyrate co 3 hydroxyvalerate ) with varied composition using different nitrogen sources with Haloferax mediterranei». Extremophiles 21(6):1037-47: Este trabajo consistió en elaborar distintos cultivos a distintas ratios de C/N con distinta fuente de nitrógeno, mientras que algunos cultivos tenían sales de nitr ato, otros tenían sales de amonio. En un inicio dan mejores resultados las sales de amonio, pero al final, las sales de nitrato dan mejores resultados. Como

10. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 09 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución las nitrato y nitrito reductasa a distintas etapas de crecimiento de H. mediterranei. También, para un futuro cosechado y una rotura celular inicial se consulta a Bhattacharyya et al., 2014, Huang et al., 2006 y Koller, 2015. Estos artículos se ha complementan con los documentos de Hwang et al., 2006 y Salgaonkar et al., 2013, ya que hablan de la cinética de crecimiento y acumulación de H. mediterranei. Bhattacharyya, Anirban, Jayeeta Saha, y Saubhik Haldar. 2014. «Production of poly-3- (hydroxybutyrate-co- hydroxyvalerate) by Haloferax mediterranei using rice-based ethanol stillage with simultaneous recovery and re-use of medium salts». 463-70: En este estudio se emplearon residuos de destilación de etanol con H. mediterranei consiguió una producción de 16,42 g/L de PHA. Además, se mejora la extracción realizada en su estudio anterior, concretamente al no realizar pretratamientos y permitiendo la reutilización de sales. Hwang, Kuo Jen, Shao Fu You, y Trong Ming Don. 2006. «Disruption kinetics of bacterial cells during purification of poly-_-hydroxyalkanoate using ultrasonication». Journal of the Chinese Institute of Chemical Engineers 37(3):209-16: Elaboran un modelo teórico en el que buscan la menor tasa de células supervivientes a la rotura celular con ultrasonidos para purificar el PHA celular. Además, se emplea la microscopia electrónica de barrido para obtener imágenes de los gránulos y caracterizarlos. Koller, Martin. 2015. «Recycling of waste streams of the biotechnological poly(hydroxyalkanoate) production by Haloferax mediterranei on whey». International Journal of Polymer Science 2015: Se comparó la producción de PHA empleando H. mediterranei con restos salinos y celulares generados en estudios previos con sales frescas y extracto de levadura. De este modo se reutilizaría material que podría ser altamente contaminante con el medioambiente. Salgaonkar, Bhakti B., Kabilan Mani, y Judith Maria Bragança. 2013. «Accumulation of polyhydroxyalkanoates by halophilic archaea isolated from traditional solar salterns of India». Extremophiles 17(5):787-95: A partir de muestras de salmuera y de sedimentos de salinas se estudió la acumulación de PHA en 7 cepas de haloarqueas. Con la tinción rojo Nilo se detectó cualitativamente y se comprobó la presencia de este polímero con la conversión hacia ácido crotónico. Las cepas se caracterizaron tanto fenotípicamente como genéticamente. Además, se estudió la cinética de crecimiento y la de acumulación de los gránulos. Con RMN se comprobó que se formó 3HB. Finalmente se buscó en bibliografía otros microorganismos que también producen PHA para poder hacer una comparación y ver si el microorganismo escogido era el correcto. Por lo que se buscaron distintos tipos de microorganismos como gram positivos Mohammed et al., 2019 y Shamala et al., 2003. También se buscaron bacterias gram negativas con esta capacidad Altamirano Leon y Ramos Romero, 2018, Cruz et al., 2014 y Urbina et al., 2018. Además, se compararon con otras haloarchaeas para tener un grupo más próximo a H. mediterranei, Han et al., 2010, Salgaonkar et al., 2013 y Zhao et al., 2015. Algunos autores hacen un estudio amplio en organismos productores y estudian de distintos taxones como Quillaguamán et al., 2010.

19. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 18 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución En el tratamiento primario o mecánico se eliminan partículas may ores como arenas y limos además de grasas, aceites y ceras (lodos primarios). En un tratamiento secundario o biológico, es donde la mayor parte de la materia orgánica disuelta y suspendida en el agua se oxida biológicamente de forma rápida en reactores especiales por medio de ciertas bacterias aeróbicas que se mantienen en un sistema bien aireado para facilitar la oxidación, reduciéndose considerablemente la demanda biológica de oxígeno (DBO). Los lodos generados en ambos tratamientos consisten fundamentalmente en agua y materia orgánica, de forma que pueden ser digeridos anaeróbicamente en un proceso que tarda varias semanas (lodos secundarios). Esta fermentación anaerobia de los lodos produce ácidos grasos de cadena corta, conocidos también como ácidos grasos volátiles (VFAs, de las siglas en inglés), precursores directos de los PHAs44. Por ello, la producción de PHA se puede acoplar en este paso de depuración de las aguas residuales. En algunos casos se aplica un tratamiento terciario, aunque no suele ser lo más común, como disposición última para las aguas residuales con el fin de reducir DBO utilizando sales de aluminio, eliminar compuestos orgánicos y metales pesados por adsorción en carbón activo, eliminación de fosfatos, de hierro y compuestos nitrogenados. Los residuos procedentes de las EDAR, aunque muy ricos en materia orgánica también poseen alta carga de contaminantes como la presencia de detergentes, sustancias químicas como coagulantes-floculantes (cloruro férrico) y anti-incrustantes (poli-acrilatos), acumulación de metales pesados, citotóxicos y biocidas. Los sustratos convencionales utilizados para la producción de PHAs son glucosa, fructosa, sacarosa, ácidos grasos de cadena corta como el ácido propiónico, azúcares de maíz, entre otros, los cuales son costosos en una escala industrial. La elección de fuentes de carbono adecuadas es un factor importante que determina el rendimiento global del proceso de fermentación e influye significativamente en el coste del producto final. Por ello, lo recomendable es elegir sustratos baratos, fácilmente disponibles y renovables, y que a su vez apoyen el crecimiento microbiano de manera eficiente. La posibilidad de emplear fuentes de carbono disponibles a bajo coste sin comprometer demasiado la productividad del proceso, como residuos procedentes del sector agroalimentario, residuos de las estaciones de tratamientos de aguas residuales (EDAR) o aguas residuales industriales (EDARI), ha abierto nuevos horizontes muy prometedores en la industria de los bioplásticos. Residuos que sean ricos en azúcares y/o ácidos grasos, o ricos en materia orgánica con potencial para su transformación en precursores de PHAs mediante tratamientos biológicos y/o físico-químicos en estas fuentes de carbono son ideales para la producción de PHAs. Con el fin de optimizar la producción de PHAs, el estudio previo de los residuos utilizados actualmente para la producción de PHAs se ha enmarcado dentro del contexto de la Región de Murcia, analizando los residuos generados dentro de la Región y su idoneidad para utilizarlos como fuente de carbono con el objetivo de desarrollar envases flexibles biodegradables que puedan ser utilizados por ejemplo en el sector alimentario

21. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 20 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Tabla 4: Macromagnitudes Industria Alimentaria -Centro Regional de Estadística de Murcia

31. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 30 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Tabla 7: Resumen de características de producción de PHA con diferentes microorganismos

52. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 51 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Tabla 14: Metodologías y sus rendimientos en distintos estudios

53. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 52 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Tabla 15: Metodologías empleadas en la bibliografía para la extracción de PHA

57. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 56 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Ferre, Anna y Guell James. 2017. «Production of the copolymer poly ( 3 hydroxybutyrate co 3 hydroxyvalerate) with varied composition using different nitrogen sources with Haloferax mediterranei». Extremophiles 21(6):1037-47. Flores, Nataly, Sebastián Hoyos, Mauricio Venegas, Alexandra Galetovi_, Lidia M. Zúñiga, Francisca Fábrega, Bernardo Paredes, Camila Salazar-Ardiles, Claudia Vilo, Carmen Ascaso, Jacek Wierzchos, Virginia Souza- Egipsy, Jorge E. Araya, Ramón Alberto Batista-García, y Benito Gómez-Silva. 2020. «Haloterrigena sp. Strain SGH1, a Bacterioruberin-Rich, Perchlorate-Tolerant Halophilic Archaeon Isolated From Halite Microbial Communities, Atacama Desert, Chile». Frontiers in Microbiology 11(March):1-18. Foreman, Jonathon, Philip S. Gill, y Steven R. Sauerbrunn. s. f. «Tensile Modulus of Plastic Films *». Polymer. Ghosh, Supratim, Rima Gnaim, Semion Greiserman, Ludmila Fadeev, Michael Gozin, y Alexander Golberg. 2019. «Macroalgal biomass subcritical hydrolysates for the production of polyhydroxyalkanoate (PHA) by Haloferax mediterranei». Bioresource Technology 271:166-73. González García, Yolanda, Juan Carlos Meza Contsrerass, Orfil González Reynoso, y Jesús Antonio Córdova López. 2013. «Síntesis y biodegradación de polihidroxialcanoatos: Plásticos de origen microbiano». Revista Internacional de Contaminacion Ambiental 29(1):77-115. Han, Jing, Jing Hou, Hailong Liu, Shuangfeng Cai, Bo Feng, Jian Zhou, y Hua Xiang. 2010. «Wide distribution among halophilic archaea of a novel polyhydroxyalkanoate synthase subtype with homology to bacterial type III synthases». Applied and Environmental Microbiology 76(23):7811-19. Han, Jing, Lin-ping Wu, Jing Hou, Dahe Zhao, y Hua Xiang. 2015. «Biosynthesis, Characterization, and Hemostasis Potential of Tailor- Made Poly(3-hydroxybutyrate- co -3-hydroxyvalerate) Produced by Haloferax mediterranei». Hermann-Krauss, Carmen, Martin Koller, Alexander Muhr, Hubert Fasl, Franz Stelzer, y Gerhart Braunegg. 2013. «Archaeal production of polyhydroxyalkanoate (PHA) Co- and terpolyesters from biodiesel industry-derived by-products». Archaea 2013. Huang, Ting-yen Huang Æ. Kow-jen Duan Æ. Shih-yow, C. Will Chen, Æ. Starch, y Æ. Repeated. 2006. «Production of polyhydroxyalkanoates from inexpensive extruded rice bran and starch by Haloferax mediterranei». 701-6. Hwang, Kuo Jen, Shao Fu You, y Trong Ming Don. 2006. «Disruption kinetics of bacterial cells during purification of poly-_-hydroxyalkanoate using ultrasonication». Journal of the Chinese Institute of Chemical Engineers 37(3):209-16.

58. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 57 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Kalia, Vipin Chandra, Subhasree Ray, Sanjay K. S. Patel, Mamtesh Singh, y Gajendra Pratap Singh. 2019. «The dawn of novel biotechnological applications of polyhydroxyalkanoates». Biotechnological Applications of Polyhydroxyalkanoates 1-11. Keshavarz, Tajalli y Ipsita Roy. 2010. «Polyhydroxyalkanoates: bioplastics with a green agenda». Current Opinion in Microbiology 13(3):321-26. Koller, Martin. 2015. «Recycling of waste streams of the biotechnological poly(hydroxyalkanoate) production by Haloferax mediterranei on whey». International Journal of Polymer Science 2015. Koller, Martin, Aid Atli_, Yolanda Gonzalez-Garcia, Christoph Kutschera, y Gerhart Braunegg. 2008. «Polyhydroxyalkanoate (PHA) biosynthesis from whey lactose». Macromolecular Symposia 272(1):87-92. Koller, Martin, Paula Hesse, Rodolfo Bona, Christoph Kutschera, Aid Atli_, y Gerhart Braunegg. 2007. «Biosynthesis of high quality polyhydroxyalkanoate Co- And terpolyesters for potential medical application by the archaeon haloferax mediterranei». Pp. 33-39 en Macromolecular Symposia. Vol. 253. Koller, Martin, Paula Hesse, Rodolfo Bona, Christoph Kutschera, y Gerhart Braunegg. 2007. «Potential of Various Archae- and Eubacterial Strains as Industrial Polyhydroxyalkanoate Producers from Whey». 218-26. Laycock, Bronwyn, Peter Halley, Steven Pratt, Alan Werker, y Paul Lant. 2014. «The chemomechanical properties of microbial polyhydroxyalkanoates». Progress in Polymer Science 39(2):397-442. Legat, Andrea, Claudia Gruber, Klaus Zangger, Gerhard Wanner, y Helga Stan-Lotter. 2010. «Identification of polyhydroxyalkanoates in Halococcus and other haloarchaeal species». Applied Microbiology and Biotechnology 87(3):1119-27. Lillo, Jose Garcia y Francisco Rodriguez-valera. 1990. «Effects of Culture Conditions on Poly ( 3-Hydroxybutyric Acid ) Production by Haloferax mediterranei». 56(8):2517-21. Liu, Guiming, Jing Hou, Shuangfeng Cai, Dahe Zhao, Lei Cai, Jing Han, Jian Zhou, y Hua Xiang. 2015. «A patatin-like protein associated with the polyhydroxyalkanoate (PHA) granules of Haloferax mediterranei acts as an efficient depolymerase in the degradation of native PHA». Applied and Environmental Microbiology 81(9):3029-38. Mangaraj, S., Ajay Yadav, Lalit M. Bal, S. K. Dash, y Naveen K. Mahanti. 2019. «Application of Biodegradable Polymers in Food Packaging Industry: A Comprehensive Review». Journal of Packaging Technology and Research 3(1):77-96.

59. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 58 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Mohammed, Seid, Ananta N. Panda, y Lopamudra Ray. 2019. «An inve stigation for recovery of polyhydroxyalkanoates (PHA)from Bacillus sp. BPPI-14 and Bacillus sp. BPPI-19 isolated from plastic waste landfill». International Journal of Biological Macromolecules 134:1085-96. Nájera-Fernández, Cindy, Basilio Zafrilla, María José Bonete, y Rosa María Martínez-Espinosa. 2012. «Role of the denitrifying Haloarchaea in the treatment of nitrite-brines». International Microbiology 15(3):111-19. Niaounakis, M. (2015). Biopolymers: applications and trends. William Andrew. Noda I., Marchessault R. H., Terada M.: Polymer data handbook. Oxford University Press, London (1999) Quillaguamán, J., Guzmán, H., Van-Thuoc, D., & Hatti-Kaul, R. (2010). Synthesis and production of polyhydroxyalkanoates by halophiles: current potential and future prospects. Applied microbiology and biotechnology, 85(6), 1687-1696. Sagong, Hye-Young, Hyeoncheol Francis Son, So Young Choi, Sang Yup Lee, y Kyung-Jin Kim. 2018. «Structural Insights into Polyhydroxyalkanoates Biosynthesis». Trends in Biochemical Sciences 43(10):790-805. Salgaonkar, Bhakti B., Kabilan Mani, y Judith Maria Bragança. 2013. «Accumulation of polyhydroxyalkanoates by halophilic archaea isolated from traditional solar salterns of India». Extremophiles 17(5):787-95. Shamala, T. R., Chandrashekar, A., Vijayendra, S. V. N., & Kshama, L. (2003). Identification of polyhydroxyalkanoate (PHA)_producing Bacillus spp. using the polymerase chain reaction (PCR). Journal of Applied Microbiology, 94(3), 369-374. Tan, Giin Yu Amy, Chia Lung Chen, Ling Li, Liya Ge, Lin Wang, Indah Mutiara Ningtyas Razaad, Yanhong Li, Lei Zhao, Yu Mo, y Jing Yuan Wang. 2014. «Start a research on biopolymer polyhydroxyalkanoate (PHA): A review». Polymers 6(3):706-54. Urbina, Leire, Phavit Wongsirichot, María Ángeles Corcuera, Nagore Gabilondo, Arantxa Eceiza, James Winterburn, y Aloña Retegi. 2018. «Application of cider by-products for medium chain length polyhydroxyalkanoate production by Pseudomonas putida KT2440». European Polymer Journal 108:1-9. Van den Oever, Martien, Karin Molenveld, Maarten van der Zee, y Harrie_tte Bos. 2017. Bio-based and biodegradable plastics_: facts and figures_: focus on food packaging in the Netherlands. Zhao, Youxi, Zhiming Rao, Yanfen Xue, Ping Gong, Yizhi Ji, y Yanhe Ma. 2015. «Biosynthesis, property comparison, and hemocompatibility of bacterial and haloarchaeal poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)». Science Bulletin 60(22):1901-10.

39. Esta condición halófila (“amante de la sal”) permite también el uso de aguas residuales industriales muy salinas, de difícil gestión, uso de agua de mar o aguas residuales de plantas desalinizadoras, y por tanto se puede reducir el consumo de agua dulce. Estos microorganismos halófilos son muy resistentes a condiciones extremas por lo que cambios de temperatura y pH no tienen un efecto importante en el desempeño del microorganismo. Además, estos microorganismos halófilos son anaerobios facultativos y pueden crecer con concentraciones bajas de oxígeno. La regulación de los niveles de oxígeno en los bioreactores es un parámetro difícil de controlar, con muchas fluctuaciones, por lo que el cultivo de un microorganismo con unos requerimientos de oxígeno que no sean críticos tiene la ventaja de que cambios de oxígeno en el proceso fermentativo no tendrán gran impacto en la supervivencia de los microorganismos ni en la producción de PHAs. En general, el proceso de producción de PHAs con microorganismos extremófilos requiere de un menor control de procesos y por tanto de instalaciones menos costosas. Otra ventaja del uso de estos microorganismos es en el proceso de extracción de los PHAs. Al ser microorganismos que crecen en altas concentraciones de sal, un choque osmótico en presencia de agua dulce provocará la rotura de sus paredes celulares, evitando con ello el uso de disolventes caros y perjudiciales para el medio ambiente. Debido a la alta concentración de sal del bioproceso, los fermentadores de acero inoxidable sufren mucho con el consiguiente incremento de los costes de mantenimiento. Este inconveniente se puede solventar fácilmente con el uso de biorreactores de plástico, al no ser necesarias las altas temperaturas de esterilización más baratos que requieren una menor inversión de capital. La Tabla 10 muestra las ventajas del uso de organismos halófilos en los bioprocesos. Tabla 10: Ventajas del uso de microorganismos halófilos en procesos biotecnológicos Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 38 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución

42. Figura 9: Comparativa entre filtrado y autoclavado Figura 10: Gráfica comparativa entre cultivos con mora esterilizada con autoclave entre cultivos tamponados y sin tamponar Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 41 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución

20. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 19 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución La industria agroalimentaria es el principal sector industrial de la Región de Murcia (Tabla 3, Tabla 4), siendo el procesado y conservación de frutas y hortalizas la actividad mas destacada, seguida del procesado y conservación de carne y elaboración de productos cárnicos. Tabla 3: Principales variables de la industria agroalimentaria-Región de Murcia CREM 2017

47. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 46 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Figura 16: Crecimiento del cultivo al 1% de carbohidratos Figura 17: Crecimiento del cultivo al 2% de carbohidratos

56. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 55 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución 3. BIBLIOGRAFÍA Alsafadi, Diya y Othman Al-Mashaqbeh. 2017. «A one-stage cultiva tion process for the production of poly- 3-(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) from olive mill wastewater by Haloferax mediterranei». New Biotechnology 34:47-53. Altamirano León, L. M., & Ramos Romero, E. (2018). Rendimiento de polihidroxialcanoatos producidos por bacterias fijadoras de nitrógeno aisladas de Asparagus officinalis L., noviembre-diciembre, 2016. Bhattacharyya, Anirban, Kuntal Jana, Saubhik Haldar, Asit Bhowmic, Ujjal Kumar Mukhopadhyay, Sudipta De, y Joydeep Mukherjee. 2015. «Integration of poly-3-(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) production by Haloferax mediterranei through utilization of stillage from rice-based ethanol manufacture in India and its techno-economic analysis». World Journal of Microbiology and Biotechnology 31(5):717-27. Bhattacharyya, Anirban, Arnab Pramanik, Sudipta Kumar Maji, Saubhik Haldar, y Ujjal Kumar Mukhopadhyay. 2012. «Utilization of vinasse for production of Haloferax mediterranei». AMB Express 2(1):1. Bhattacharyya, Anirban, Jayeeta Saha, y Saubhik Haldar. 2014. «Production of poly-3- ( hydroxybutyrate-co- hydroxyvalerate ) by Haloferax mediterranei using rice-based ethanol stillage with simultaneous recovery and re-use of medium salts». 463-70. Bugnicourt, E., P. Cinelli, A. Lazzeri, y V. Alvarez. 2014. «Polyhydroxyalkanoate (PHA): Review of synthesis, characteristics, processing and potential applications in packaging». Express Polymer Letters 8(11):791-808. Cruz, Madalena V, Alexandre Paiva, Pedro Lisboa, Filomena Freitas, Pedro Simões, Susana Barreiros, y Maria A. M. Reis. 2014. «CEER - Biosystems Engineering Center , Instit ute of Agronomy , University of Lisbon , 1349- 017». BIORESOURCE TECHNOLOGY. Dawes, Edwin A. y Peter J. Senior. 1973. «The Role and Regulation of Energy Reserve Polymers in Micro- organisms». Advances in Microbial Physiology 10©:135-266. Farris, Giuseppe, Patrizia Cinelli, Irene Anguillesi, Sara Salvadori, Maria Beatrice Coltelli, y Andrea Lazzeri. 2014. «Effect of ageing time on mechanical properties of plasticized poly(hydroxybutyrate) (PHB)». AIP Conference Proceedings 1599:294-97. Ferre-Guell, Anna y James Winterburn. 2018. «Biosynthesis and Characterization of Polyhydroxyalkanoates with Controlled Composition and Microstructure». Biomacromolecules 19(3):996-1005.

12. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 11 Urbina, Leire, Phavit Wongsirichot, María Ángeles Corcuera, Nagore Gabilondo, Arantxa Eceiza, James Winterburn, y Aloña Retegi. 2018. «Application of cider by-products for medium chain length polyhydroxyalkanoate production by Pseudomonas putida KT2440». European Polymer Journal 108:1-9: En este documento se utilizan subproductos de sidra como fuente de carbono para producir PHA, concretamente mcl-PHA, empleando Pseudomonas putida como organismo productor. Estos cultivos no utilizan ningún tipo de precursor y no se empleó ningún tratamiento previo. Zhao, Youxi, Zhiming Rao, Yanfen Xue, Ping Gong, Yizhi Ji, y Yanhe Ma. 2015. «Biosynthesis, property comparison, and hemocompatibility of bacterial and haloarchaeal poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) ». Science Bulletin 60(22):1901-10: Se compararon lo polímeros producidos en Halogranum amylolyticum (PHBV- H) y en Ralstonia eutropha (PHBV-B) con contenido en 3HV. Se comprobó que sus propiedades físicas difieren dependiendo del organismo productor y de la fuente. Esto afecta directamente a biodegradabilidad y biocompatibilidad de los polímeros. El apartado 3 bibliografía muestra todas las referencias consultadas. 1.2 Tarea 1.1. Determinación de PHAs objetivo Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son polímeros biodegrables formados por monómeros de ácidos hidroxialcanóicos. Los PHAs pueden estar formados por un sólo tipo de monómero (homopolímero) o por más de un tipo de monómeros (copolímeros). A su vez, dependiendo de la longitud del monómeros que componen los polihidroxialcanoatos se pueden clasificar como: 1. PHA de longitud de cadena corta scl-PHA con monómeros de 3 a 5 átomos de carbono. 2. PHA de longitud de cadena media mcl-PHA, con monómeros de 6 a 14 átomos de carbono. 3. PHA de longitud de cadena larga lcl-PHA, con monómeros con mas de 15 átomos de carbono.

3. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 02 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Tracción 13 Figura 2: Deformación en tracción 13 Figura 3: Residuos más utilizados como fuente de carbono para la producción de PHAs 15 Figura 4: Esquema del proceso de depuración de aguas residuales 17 Figura 5: Residuos de la industria de las golosinas 26 Figura 6: Gránulos de PHA intracelulares 28 Figura 7: Rutas para la obtención de PHAs 29 Figura 8: Ruta metabólica de aprovechamiento energético de los azúcares 33 Figura 9: Comparativa entre filtrado y autoclavado 41 Figura 10: Gráfica comparativa entre cultivos con mora esterilizada con autoclave entre cultivos tamponados y sin tamponar 41 Figura 11: Esquema obtención microorganismos halófilos 42 Figura 12: Cultivo de Haloferax mediterranei R4 (H. mediterranei) 43 Figura 13: Residuo golosina mora como fuente de carbono 43 Figura 14: Filtración de la solución stock de mora 44 Figura 15: Bioreactor de laboratorio con control de temperatura, agitación, pH y adición de nutrientes 45 Figura 16: Crecimiento del cultivo al 1% de carbohidratos 46 Figura 17: Crecimiento del cultivo al 2% de carbohidratos 46 Figura 18: Crecimiento del cultivo al 4% de carbohidratos 47 Figura 19: Precultivo a partir del que se obtiene los inóculos y sin ningún tipo de estrés 48 Figura 20: Cultivos al 1% de carbohidratos antes de su cosechado 48 Figura 21: Cultivos al 2% de carbohidratos antes del cosechado 49 Figura 22: Cultivos al 4% de carbohidratos antes del cosechado 49 Figura 23: El tubo Eppendorf de la izquierda es un cultivo centrifugado y el de la derecha es un tubo Eppendorf del mismo cultivo sin centrifugar 50 Figura 24: Tubos falcón tras el cosechado y al final de los lavados con agua de sales 50

4. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 03 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución 1 SELECCIÓN DE RESIDUOS Y MICROORGANISMOS ÓPTIMOS PARA LA PRODUCCIÓN DE PHA 1.1 Revisión bibliográfica A continuación, analizaremos los documentos que se han empleado para la elaboración del trabajo. Observaremos como han influido en su respectivo campo cada artículo y libro en los distintos apartados. Primero se ha consultado en la bibliografía sobre los PHA. Para definir lo que son y los tipos de estos se han empleado Bugnicourt et al., 2014, Sagong et al., 2018 y Tan et al., 2014. Bugnicourt, E., P. Cinelli, A. Lazzeri, y V. Alvarez. 2014. «Polyhydroxyalkanoate (PHA): Review of synthesis, characteristics, processing and potential applications in packaging». Express Polymer Letters 8(11):791-808: En este artículo se evalúan los tipos de PHA existentes, las propiedades que estos presentan, sus aspectos de procesamiento, las limitaciones que tienen y las mejoras que se plantean para aplicaciones específicas. Sagong, Hye-Young, Hyeoncheol Francis Son, So Young Choi, Sang Yup Lee, y Kyung-Jin Kim. 2018. «Structural Insights into Polyhydroxyalkanoates Biosynthesis». Trends in Biochemical Sciences 43(10):790-805: En esta revisión bibliográfica se realiza un análisis de todos los métodos de síntesis de PHA, concretando en las acciones de las enzimas PhaC y PhaB. También se mencionan los procesos de degradación que tienen estos polímeros por la enzima PhaZ. Tan, Giin Yu Amy, Chia Lung Chen, Ling Li, Liya Ge, Lin Wang, Indah Mutiara Ningtyas Razaad, Yanhong Li, Lei Zhao, Yu Mo, y Jing Yuan Wang. 2014. «Start a research on biopolymer polyhydroxyalkanoate (PHA): A review». Polymers 6(3):706-54: En esta review se recopilan un conjunto de cultivos microbianos con capacidad de almacenar PHA que están comercialmente disponibles. Además, se habla de las vías de biosíntesis de PHA y de los métodos llevados a cabo para la detección, extracción y el análisis del PHA obtenido. Para conocer a los organismos productores, la síntesis de estos, los motivos de acumulación y sustratos empleados se ha consultado esta bibliografía Dawes y Senior, 1973, González García et al., 2013, Keshavarz y Roy, 2010 y Mangaraj et al., 2019. Dawes, Edwin A. y Peter J. Senior. 1973. «The Role and Regulation of Energy Reserve Polymers in Micro- organisms». Advances in Microbial Physiology 10©:135-266: En este documento se tratan las principales moléculas de energía que emplean los microorganismos. Contiene su síntesis, degradación, metabolismo, etc. Koller, Martin, Aid Atli_, Yolanda Gonzalez-Garcia, Christoph Kutschera, y Gerhart Braunegg. 2008.

23. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 22 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Estas actividades generan lodos en las EDAR ( estaciones de depu ración de aguas residuales), con un elevado contenido en materia orgánica biodegradable (DBO>1000 mg/l). Además, la industria agroalimentaria produce residuos sólidos procedentes de la manipulación y procesado. La elección de las fuentes de carbono adecuadas es un factor imp ortante que determina el rendimiento global del proceso de producción del PHA e influye significativamente en el coste del producto final. Los sustratos utilizados normalmente son: carbohidratos o azúcares simples (como glucosa, fructosa y galactosa) y triacilgliceroles. La mayoría de microorganismos productores de PHA utilizan los azúcares simples mientras que el metabolismo del triacilglicerol y los hidrocarburos (hexanoato, octanoato, decanoato, dodecanoato), es más limitado. Los azúcares sencillos pueden ser fermentados directamente para producir PHAs. Sin embargo, oligosacáridos (como sacarosa y lactosa) y polisacaráridos (almidones) deben ser hidrolizados previamente para poder ser utilizados por la mayoría de microorganismos. Los triacilgliceroles, ácidos grasos unidos a un esqueleto de glicerol, provienen de grasas animales y aceites vegetales. Éstos pueden ser fermentados directamente por los microorganismos que puedan secretar lipasas durante el proceso de fermentación y liberar ácidos grasos a partir de las moléculas de triacilglicerol. Así, estos ácidos grasos serán transportados al interior celular y serán catabolizados via _-oxidación para producir PHAs. Estudios han demostrado que la acumulación y composición de PHA y los tiempos en los que se alcanza la máxima concentración de PHA están afectados por las condiciones nutricionales, como los ratios de carbono-nitrógeno (C/N). No solo el ratio C/N afecta a la acumulación de PHA sino que el tipo de fuente de nitrógeno (N) se ha visto que puede variar la composición de los copoliésteres. Para la selección de los residuos de partida para la fabricación de PHAs se han tenido en cuenta los siguientes criterios: 1. Alto contenido en carbohidratos como fuente de carbono de los microorganismos productores de bioplástico. 2. Estacionalidad y/o regularidad, Homogeneidad de la composición en el tiempo. 3. Composición nutricional y presencia de sustancias tóxicas. 4. Disponibilidad de cantidades elevadas de residuos. Estacionalidad y/o regularidad A diferencia de los procesos basados en sustratos purificados, la utilización de materiales de desecho para la producción de PHA nos confronta con la cuestión de la disponibilidad de la materia prima durante todo un año de producción y su almacenamiento, especialmente para materiales lignocelulósicos durante la

24. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 23 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución temporada baja, cuando no se realiza la cosecha. En general, hay que distinguir entre los flujos de desechos que se acumulan durante todo el año en cantidades más o menos constantes (efluentes industriales de la industria láctea, industria de las golosinas, industria cerve cera, de procesado de frutas y verduras, etc), y otros con una disponibilidad que fluctúa fuertemente con el tiempo (algunos residuos sólidos como rechazos de verduras y frutas (tomates, arroz, etc), pieles de frutas y vegetales). El factor "disponibilidad estacional" es crucial para que la planificación y el diseño de las instalaciones de producción de PHA se integren en las plantas industriales existentes. Composición y pre-tratamientos necesarios A menudo, los compuestos orgánicos asociados con los desechos del sector agroalimentario son compuestos complejos, ricos en lignina, celulosa y hemicelulosa, que no pue den ser utilizados directamente por los organismos productores de PHAs. Es por ello que frecuentemente se necesita un pretratamiento de los residuos, como tratamientos químicos o biológicos (fermentación anaerobia o tratamientos enzimáticos), para convertir estas moléculas complejas en precursores directos de los PHAs como en azúcares simples como glucosa y ácidos grasos como los ácidos acético o propiónico. Además de sus componentes principales, los flujos de residuos complejos pueden contener sustancias adiciones que los hacen ventajosos en comparación directa con sustratos puros y costosos (como el suero excedente de la industria láctea rico en lactosa además de miner ales y proteínas), o por el contrario contener componentes no fermentables e incluso compuestos con efectos inhibitorios sobre el crecimiento microbiano, como fenoles (derivados de la industria del aceite de oliva y concentrados en el alperujo), alcoholes (como los residuos de metanol en la fase de glicerol derivados de la producción de biodiesel). Como se comentó anteriormente, el suero derivado de la producción de queso constituye uno de los residuos con más notas bibliográficas en la producción de PHAs. En la Región de Murcia contamos con importantes empresas dedicadas a la fabricación de productos lácteos como Quesos Ruperto, Palancares alimentación, Symbiote, Costaimbernon o Dairy Vialitt, por lo que los excedentes de suero lácteo son abundantes diariamente y podrían constituir una fuente de materi a prima para la producción de PHA. Sin embargo, solo algunos microorganismos cuentan con las enzimas apropiadas para la transformación directa de lactosa en PHA directamente. El uso eficiente del suero como fuente de carbono para la producción de PHA se ve obstaculizado por problemas en los pretratamientos del suero y la elección de las cepas de microorganismos productores de PHAs. Así la mayoría de los microorganismos carecen de esta actividad enzimática o la poseen en niveles no muy elevados, lo que implic a un pretratamiento de hidrólisis enzimática o química del suero, o la utilización de cepas modificadas genéticamente, con el consecuente incremento económico en el precio final de PHA .

44. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 43 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución El microorganismo seleccionado ha sido Haloferax mediterranei R4 (H. mediterranei) (Figura 12). Este produce los gránulos de PHA cuando tiene un exceso de fuente de carbono y presenta una limitación alimentaria de nitrógeno, fósforo y/o oxígeno. H. mediterranei es capaz de emplear una gran variedad de sustratos como fuente de nutrientes tanto para su crecimiento como para la formación de los PHAs, en nuestro caso emplearemos residuos industriales de la industria de las golosinas. Estos microorganismos se encuentran en las salinas del levante español, por lo que se pueden obtener cultivos mixtos de salinas o salmueras de desaladoras. La H. mediterranei se trata de un organismo extremófilo que requiere de una concentración de agua de sales entorno al 25%. Figura 12: Cultivo de Haloferax mediterranei R4 (H. mediterranei) Figura 13: Residuo golosina mora como fuente de carbono

26. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 25 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución productos químicos podrían afectar al ciclo vital y por tanto rendimiento de los microorganismos encargados de la producción de PHAs utilizando esta materia orgánica. Todavía más preocupante es el hecho de que parte de parte de estos compuestos químicos y tóxicos, como los insecticidas organohalogenados con propiedades cancerígenas o los policlorobifenilos, presentan gran resistencia a la degradación biológica y por su carácter liposoluble tienden a bioacumularse pudiendo llegar al ser humano a través de la cadena alimentaria. Estudios de los contaminantes presentes en las aguas de las EDAR antes y pos-tratamiento revelaron que el porcentaje medio de reducción de los compuestos orgánicos era del 20,1%, aunque el comportamiento de cada compuesto fue muy diferente. Así por ejemplo para algunos compuestos se vió hasta una reducción de más del 80% como para el etil paratión, etión, prometrina, dibromoclorometano y organohalogenados, mientras que para otros compuestos la reducción fue menor del 10% como para el 1,2-dicloroetano, aldrín, heptacloro, heptacloro epóxido, diazinón, terbutrina, metilparatión, tricloroetileno, endosulfán I y II, bromoformo o benzo(k)fluoranteno50. En referencia a los metales pesados los datos obtenidos presentaron una concentración media total de metales de 1,38 mg/L en agua organohalogenados, mientras que para otros compuestos la reducción fue menor del 10% como para el 1,2-dicloroetano, aldrín, heptacloro, heptacloro epóxido, diazinón, terbutrina, metilparatión, tricloroetileno, endosulfán I y II, bromoformo o benzo(k)fluoranteno 18 . En referencia a los metales pesados los datos obtenidos presentaron una concentración media total de metales de 1,38 mg/L en agua bruta frente a 0,52 mg/l en agua depurada, con una tasa de reducción media en planta del 62,3%, con porcentajes máximos de reducción para el Fe (68,9%) y superiores al 60% para As, Pb y Se, y mínimas para arsénico, níquel o mercurio. De cara al objetivo de este proyecto de diseñar envases flexibles destinados principalmente al sector agroalimentario, descartamos la posibilidad de acoplar la producción de PHAs con los residuos (lodos) generados en las EDAR debido a su carácter tóxico y su posible repercusión de cara a destinar estos envases para productos de consumo humano o como material biocompatible para usos en biomedicina. De acuerdo con los criterios considerados anteriormente: De acuerdo con los criterios considerados anteriormente: 1. Composición nutricional: residuos ricos en fuente de carbohidratos principalmente azúcares simples. 2. Disponibilidad: residuos ampliamente disponibles durante todo el año y que no atiendan a la estacionalidad. 3. Pretratamientos necesarios: residuos que no necesiten pretratamientos que encarezcan el proceso de producción de PHAs. 4. Presencia de sustancias tóxicas: residuos que no presentes sustancias tóxicas o no bioasimilables que puedan interferir con el rendimiento de los microorganismos y además puedan ser un problema de cara 18 Rafael Marín. Contaminantes emergentes y metales pesados en aguas residuales: un caso de estudio. Retema: revista técnica de medio ambiente. No193, Septiembre/Octubre 2016.

27. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 26 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución a destinar los PHAs producidos para la fabricación de envases para uso alimentario. 5. Volumen producido anualmente: que se produzcan grandes volúmenes de residuos en la Región de Murcia que puedan permitir posteriormente el escalado industrial hay un tipo de residuo que se ha considerado óptimo como punto de partida para la fabricación a escala industrial de PHAs, los residuos de las industrias de golosinas. Tres empresas murcianas son líderes en la fabricación de gominolas y golosinas, con una producción mensual de las tres empresas más importantes, Fini, Vidal Golosinas y Jake, de 12.500 Tm/año y generación de residuos sólidos solubles en agua con alto contenido en glucosa de 125 Tm/mes. Estos residuos se caracterizan por su elevado contenido en azúcares simples, precursores directos de PHAs, óptimo para el desarrollo de la biomasa necesaria para la producción de PHA, sin presencia de sustancias tóxicas, ampliamente disponibles durante todo el año y sin neces idad de costosos pretratamientos, lo que permitirá reducir significativamente los costos de producción. Las aguas residuales provenientes de esta misma industria, aunque en menor concentración, también contiene azúcares como glucosa, fructosa, maltosa, sacarosa (3.3 g/100 ml), y restos de nitrógeno orgánico y fósforo que pueden ser utilizados por los microorganismos para producir PHAs. La mayoría de microorganismos productores de PHAs necesitan altas cantidades de la fuente de carbono y una limitación de otros nutrientes como nitrógeno o fósforo, por ello estos residuos ricos en azúcares y en menor proporción en nitrógeno y fósforo podrían constituir residuos ideales para propiciar la formación y acumulación de PHAs. Estos residuos al estar formados mayoritariamente por azúcares simples no necesitan pretratamientos costosos y los podemos encontrar durante todo el año, eliminando así el p roblema de la estacionalidad de otros residuos agroalimentarios. Los residuos preseleccionados para el sistema piloto de producción de PHA, procedentes de la industria de las golosinas, han sido los siguientes: 1. Almidón 2. Moras 3. Regalíz 4. Chicle 5. Gominola Figura 5: Residuos de la industria de las golosinas

45. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 44 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Los medios de cultivo que se han empleado una mezcla de agua de sales con una concentración stock al 30% y se lleva a una concentración final de 25% (por litro, 1,1g de Cl2Ca, 0,7g de BrNa, 0,2g de NaHCO3, 6g de ClK, 41,5g de Cl2Mg · 6H2O, 59,3g de SO4Mg · 7H2O y 234g de ClNa), FeCl3 al 5%, KNO3 al 1%, NaH2PO4 a 0,05M, una solución de mora que es el residuo industrial empleado, cuya concentración se ha variado desde el 1% al 4%. El residuo de mora, Figura 13, se ha disuelto previamente en agua destilada en una solución stock. Para conocer cuántos gramos de mora eran necesarios para obtener uno, dos o cuatros gramos de carbohidratos en el medio se han empleado los datos de la Tabla 11. Tabla 11: Valor nutricional del residuo golosina de mora. Fuente: Empresa de golosinas de Murcia El medio de cultivo completamos con agua destilado para tener un volumen final de 100ml. De estos componentes el agua de sales, el agua destila y el KNO3 fueron autoclavados, mientras que el NaH2PO4 y FeCl3 y el residuo de mora fueron filtrados. Figura 14: Filtración de la solución stock de mora

48. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 47 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Figura 18: Crecimiento del cultivo al 4% de carbohidratos Tras analizar todos los valores que hemos obtenido, se puede deducir que la mejor longitud de onda de las tres para estudiar el crecimiento del cultivo es 600 nm. Esta es la que presenta valores más uniformes durante toda la evolución del cultivo, ya que se mide directamente el material celular y sufre menos inferencias con el medio. Si observamos los primeros puntos de los cultivos, se observa que se obtienen valores entorno a cero o incluso negativos con las longitudes de onda de 520 nm y 550 nm, pero a 600 nm se obtienen valores positivos crecientes, lo que puede ser debido a que a se mide el metabolismo primario celular. Mientras, las longitudes de onda de 520 y 550 nm miden un metabolito secundario, dando unos valores que al inicio corresponden con lo producido en el cultivo previo, de modo que hasta que no crece lo suficiente el cultivo, estos valores no aumentan. Tabla 12: .Densidades ópticas alcanzadas por todos los cultivos y sus tasas de crecimiento Si se comparan las tasas de crecimiento que aparecen en la Tabla 12 con las tasas de crecimiento que aparecen en bibliografía, se puede percibir que son similares a las de Ferre y James en las condiciones que han empleado sales de amonio. Si se comparan con las sales de nitrato, nuestras tasas de crecimiento son claramente superiores, lo que puede indicar que un menor estrés, aunque eso no significa que tenga u na productividad menor. Por otro lado, si lo comparamos con los dos artículos de Bhattacharyya, nos ocurre el caso contrario. H. mediterranei en nuestro caso ha sufrido mayor estrés.

49. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 48 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Tabla 13: Tasas de crecimiento obtenidas por bibliografía De los resultados finales se puede concluir que cuanta mayor concentración de carbohidratos tiene el medio de cultivo, mayor absorbancia se obtiene. Sin embargo, las tasas de crecimiento no siguen una linealidad con la concentración de carbohidratos. La duración de todos los cultivo s dura aproximadamente el mismo tiempo en alcanzar la fase estacionaria y la fase exponencial. Figura 19: Precultivo a partir del que se obtiene los inóculos y sin ningún tipo de estrés Figura 20: Cultivos al 1% de carbohidratos antes de su cosechado

51. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 50 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Figura 23: El tubo Eppendorf de la izquierda es un cultivo centrifugado y el de la derecha es un tubo Eppendorf del mismo cultivo sin centrifugar Figura 24: Tubos falcón tras el cosechado y al final de los lavados con agua de sales 2.2.4. Diseño experimental para la extracción de PHA Para saber la producción de PHA de cada cultivo se plantea realizar la extracción y purificación. Se han estudiado tipos de extracciones realizadas en bibliografía para el diseño, de modo que se han elaborado la Tabla 15 y la Tabla 16 para recopilar la información encontrada.

54. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 53 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución A partir del cosechado se realizará el experimento, en el que se combinaran los protocolos de (Koller, 2015) y el de (Hwang et al., 2006) y se comparará con la metodología empleada en (Koller et al., 2008) Para ruptura celular se empleará agua destilada, ya que la presión osmótica será capaz de romper las células y para asegurar que todas las células se rompan se agitará por inversión hasta conseguir que su suspensión. Seguidamente, se centrifugan a 4000 rpm para separar los gránulos de PHA de los fragmentos por la diferencia de densidad respecto al resto de células, quedando los gránulos en el fondo y los restos celulares en suspensión, permitiendo separar con un desnatado (Koller, 2015). Después, se disuelve en cloroformo para purificar los gránulos de PHA. Para asegurar que no se arrastra ningún tipo de resto se realiza una filtración, de modo que los gránulos pasaran al estar disuel tos. Finalmente, realiza un secado al vacío para eliminar el cloroformo y tener el PHA puro y aislado (Hwang et al., 2006). Seguidamente se pesará para calcular su productividad y su rendimiento a partir del sustrato. Antes de realizar los cálculos realizaremos la comprobación de que el producto obtenido es PHA (Salgaonkar et al., 2013). Esta comprobación es cualitativa, empleando el espectrofotómetro para ver si se produce PHA. Se digerirán las muestras con 5 ml de ácido sulfúrico concentrado en un baño María durante 30 min a 90 ° C, lo que debe producir una transformación de ácido sulfúrico en ácido crotónico, el cuál es cuantificable a 235 nm. A continuación, en el espectrofotómetro se realizará un barrido entre 200 nm y 260 nm, de modo que debe aparecer un pico en 235 nm. La productividad se calculará y el rendimiento se calcularán con las siguientes ecuaciones. Una vez realizada la extracción y se conozca la productividad de los 3 cultivos a distintas concentraciones de carbohidratos, se comparan y se determinará cuál es la mejor. Las posibilidades son: 1. El cultivo de 1% de carbohidratos es el que mejor rendimiento presenta. Se valora realizar cultivos a una menor concentración de carbohidratos para intentar optimizar más el cultivo, ya que, si podemos producir la misma cantidad de PHA o más cantidad con menos sustrato, serí a un proceso mucho más rentable. 2. El cultivo de 4% de carbohidratos es el que mejor rendimiento presenta. Se plantean crear cultivos con una mayor concentración de carbohidratos para aumentar el estrés al que se han sometido las células. 3. El cultivo de 2% de carbohidratos es el que mejor rendimiento presenta. En este caso, se continua con el escalado y/o la optimización del método de aislamiento y extracción. 4. Dos o más condiciones presentan un rendimiento similar. En este caso la condición ideal es la que menos cantidad de mora necesita.

13. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 12 Según la distribución de los monómeros, los copolímeros pueden ser al azar (random) o en bloque, en los copolímeros al azar los monomeros están distribuidos de forma aleatoria, mientras que en los en bloque los monómeros se agrupan a lo largo de la cadena del polímeros formando segmentos de unidades repetidas de uno de los monómeros. AAA B A BB A B A BBB AA B A BB AAA BB AA B A B Copolímero al azar AAAAAAAAAAA BBBBBBBBBBB AAAAAAAAA Copolímero en bloque El PHA más estudiado es el P3HB, y se caracteriza por su alta fragilidad y rigidez debido a su alta cristalinidad. El aumento de la cristalinidad de este tipo de PHA se produce a temperatura ambiente, por lo que la rigidez de P3HB puede aumentar durante el almacenamiento 1 , por un aumento del grado de cristalinidad. La propiedad de rigidez se traduce en una falta de elasticidad del material, de manera que el material deforma poco al aplicar un esfuerzo de tracción. Si sobre un material aplicamos una fuerza de tracción (Figura 1) se produce una deformación en la dirección de aplicación de la fuerza (Figura 2). 1 Farris, G., Cinelli, P., Anguillesi, I., Salvadori, S., Coltelli, M. B., & Lazzeri, A. (2014, May). Effect of ageing time on mechanical properties of plasticized poly (hydroxybutyrate)(PHB). In AIP Conference Proceedings (Vol. 1599, No. 1, pp. 294-297). American Institute of Physics. Tabla 1: Monómeros formadores de PHAs

41. de los resultados en la producción de bioplásticos biodegradables, mediante una tecnología totalmente novedosa. Desde una perspectiva económica, social y medioambient al este proceso supone una gran innovacióna nivel regional ya que permite implementar en la Región de Murcia la primera solución tecnológica capaz de producir un nuevo material PHA a partir de residuos agroalimentarios y microorganismos halófilos de una forma económicamente viable. Para el diseño e implementación del sistema piloto se han decidido las siguientes etapas de procesos y su validación a escala de laboratorio (1l) y posterior escalado a proceso piloto (10-30 l). Se ha comenzado la experimentación con los residuos y microorganismos seleccionados, con el fin de validar la viabilidad de este método, y así poder optimizar el proceso a escala piloto durante las siguientes anualidades (2020-2021). 2.1 Tarea 2.1. Pretratamiento de residuos Dado que los microorganismos halófilos son capaces de producir 3PHB-co-3HV sin necesidad de precursores directos, a partir de carbohidratos simples, el pretratamiento de residuo consiste únicamente en su molido y disolución en el medio salino si es sólido, no siendo necesar ios pretratamientos previos como hidrólisis ácida, o fermentación anaerobia. Los primeros estudios de laboratorio se han realizado con la mora, el residuo que mayor contenido de carbohidratos presenta, menor cantidad de grasas y proteínas, y mejor se disuelve en la disolución salina. Se han estudiado las técnicas de esterilización, para ver la mej or forma de esterilizar el residuo. Para ello se ha comparado dos técnicas de esterilización: 1. Filtrado a través de filtro de 0,20 μ m. 2. Autoclavado 20 minutos a 121ºC. Los resultados se muestran en la Figura 9, midiendo el crecimiento celular mediante espectroscopía UV- VIS a diferentes longitudes de ondas (520,550 y 600 nm). Como se puede observar, hay una gran diferencia entre ambas metodologías. Se sospechó hubiera variaciones de pH durante el autoclavado, por lo que se tamponaron las disoluciones salinas . Los resultados se muestran en la Figura 10. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 40 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución

33. Tabla 8: Microorganismos y su nutriente limitante en la producción de PHA El PHA permite la supervivencia de las bacterias frente a carencia de nutrientes, tanto en el caso de bacterias, tanto en el caso de bacterias esporuladas como no esporuladas. La síntesis de PHAs está vinculada a procesos metabólicos como glicolisis, ciclo de Krebs, _-oxidación, síntesis de ácidos grasos, catabolismo, ciclo de Calvin, procesos metabólicos de la serina. Como sustancia intermedia en los procesos de metabolismo del PHA se encuentra la acetil-CoA, en algunos microbios productores de PHA como Cupriavidus necator, Chromatium vinosum y Pseudomonas aeruginosa, el flujo del metabolismo de la acetil-CoA a PHA es altamente dependiente de la cantidad de nutrientes, bajo condiciones ricas en nutrientes, los altos niveles de Co se inhiben la producción de PHA, la acetil-CoA es utilizada en el ciclo de Krebs para producir energía y crecimiento celular. En condiciones de nutrientes desequilibrados, donde hay carencia de nitrógeno y fósforo, y exceso de carbono, los niveles de Co-A no son inhibitorios, permitiendo al acetil-CoA participar en la sintesis de PHA. Las enzimas involucradas en la biosíntesis de los PHAs son: (3-H2MB-CoA, 3-hydroxy-2-methylbutyryl-CoA; 3-H4MV-CoA, 3-hydroxy-4-methylvaleryl-CoA; 3-HV-CoA, 3- hydroxyvaleryl-CoA; 3-H2MV-CoA, 3-hydroxy-2-methylvaleryl-CoA; 4-HB-CoA, 4-hydroxybutyryl-CoA; 3-HB- CoA,3-hydroxybutyryl-CoA; (R)-3-HA-CoA, (R)-3-hydroxyacyl-CoA; 4,5-HA-CoA, 4,5-hydroxyacyl-CoA, aunque los conocimientos actuales se reducen a la síntesis con (R)-3-HA-CoA no valida para la síntesis de una gran variedad de monómeros y monómeros de los lcl-PHAs 23 . 23 Tan, G. Y., Chen, C. L., Li, L., Ge, L., Wang, L., Razaad, I., ... & Wang, J. Y. (2014). Start a research on biopolymer polyhydroxyalkanoate (PHA): a review. Polymers, 6(3), 706-754. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 32 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución

9. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 08 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución podemos apreciar estas primeras dan una concentración de biomasa de 10,7 g/l con una acumulación de 4,46% de PHBV, mientras que las sales de nitrato obtienen 5,6 g/l de biomasa con 9,3% de PHBV. Además, se empleó 3-hidroxivalerato (HV) como precursor aumentando la concentración a 6,6% y a 9,4%, respectivamente en la ratio 42 y modificó la composición del PHBV. Ghosh, Supratim, Rima Gnaim, Semion Greiserman, Ludmila Fadeev, Michael Gozin, y Alexander Golberg. 2019. «Macroalgal biomass subcritical hydrolysates for the production of polyhydroxyalkanoate (PHA) by Haloferax mediterranei». Bioresource Technology 271:166-73: Se evaluó la composición de 7 macroalgas distintas para emplearlas como fuente de carbono para la síntesi s de PHAs con H. mediterranei. Se determinó que la mejor era Ulva sp., ya que llegó a tener unos resultados de 3,8 ± 0,12 g/l de biomasa y una producción de PHA de 2,2 ± 0,12 g/l. Además, se utilizó poli 3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato como principal constituyente. Hermann-Krauss, Carmen, Martin Koller, Alexander Muhr, Hubert Fasl, Franz Stelzer, y Gerhart Braunegg. 2013. «Archaeal production of polyhydroxyalkanoate (PHA) Co- and terpolyesters from biodiesel industry-derived by-products». Archaea 2013: En este estudio se emplean residuos de glicerol de la producción de biodiesel para la producción de PHA. Además, se compararon los resultados con glicerol puro sin utilizar esterilidad. También se analizó el consumo del glicerol y la producción de PHA respecto al tiempo. Legat, Andrea, Claudia Gruber, Klaus Zangger, Gerhard Wanner, y Helga Stan-Lotter. 2010. «Identification of polyhydroxyalkanoates in Halococcus and other haloarchaeal species». Applied Microbiology and Biotechnology 87(3):1119-27: Se han analizado 20 microorganismos de la familia Halobacteriaceae para evaluar su capacidad productora de PHAs. Para ello se utilizan tinciones negro Sudán, azul Nilo o rojo Nilo, microscopia electrónica de transmisión y RMN. De este modo se detectan los gránulos y se confirma químicamente que son gránulos de PHA. Liu, Guiming, Jing Hou, Shuangfeng Cai, Dahe Zhao, Lei Cai, Jing Han, Jian Zhou, y Hua Xiang. 2015. «A patatin-like protein associated with the polyhydroxyalkanoate (PHA) granules of Haloferax mediterranei acts as an efficient depolymerase in the degradation of native PHA». Applied and Environmental Microbiology 81(9):3029-38: Se realiza un estudio genético de una PHA polimerasa (PhaZh1) similar a la patatina en H. mediterranei. Se crearon mutantes dirigidos para determinar su esencialidad en la hidrólisis de los gránulos de PHA. En esta hidrólisis se produce un monómero, 3HB, que se emplea en la síntesis de acetato. Esto indica que PhaZh1-BdhA es determinante para la degradación de PHA in vivo. Nájera-Fernández, Cindy, Basilio Zafrilla, María José Bonete, y Rosa María Martínez-Espinosa. 2012. «Role of the denitrifying Haloarchaea in the treatment of nitrite-brines». International Microbiology 15(3):111-19: Se realiza un estudio de la capacidad para desnitrificar aguas contaminadas con nitrito y nitrato a distintas concentraciones con el fin de biorremediación de estas aguas. Además, se estudiaron las actividades de

22. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 21 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Son abundantes los grupos agroalimentarios situados en la Región de Murcia que ocupan las primeras posiciones en diversos rankings nacionales (Alimarket,2020), en la fabricación de productos como: 1. Zumos, vinos y mostos ; Tropicana Alvalle S.L., Gil Family States S.L., Ramón Bilbao Vinos y Viñedos S.L., Capel Vinos S.A., Bodegas Madrid Romero, García Carrión S.A., AMC Group Fresh and Juices S.A., Riverbend España S.A., Derivados Cítricos S.A., Juvera Alimentación S.L. 2. Conservas vegetales; Hero España S.A., Marín Gimenez Hermanos S.A., Hida Alimentación S.A., 3. Confitería: Vidal Golosinas S.A., Sánchez Cano S.A. (Golosinas Fini), Dulceplus Golosinas S.A., Jake S.A. 4. Cárnicas: Grupo Fuertes, Grupo Alimentario de Lorca S.L, Hijos de Juan Pujante S.A. No se han encontrado estadísticas oficiales con estimaciones o c ifras de residuos orgánicos producidos por la industria agroalimentaria en Murcia, aunque si algunos datos procedentes de diferentes publicaciones. Del agua suministrada a establecimientos industriales, el 49% s e destina a actividades agroalimentarias 14 (Tabla 5). 14 Bionet Ingeniería. VII Jornadas Técnicas de Depuración y Mantenimiento. Murcia 2011 Tabla 5: Consumo de agua por actividad agroalimentaria4

43. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 42 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución El crecimiento de los microorganismos mejora al estabilizar el valor de pH, pero no llega a los niveles alcanzados en la esterilización por filtración, por lo que hay o tro factor que afecta al crecimiento de las arqueas cuando se autoclava el residuo de mora, que podría ser la caramelización de los azúcares haciendo que estos dejen de estar disponibles para el microorganismo. 2.2 Tarea 2.2. Obtención del PHA a escala laboratorio y validación. 2.2.1. Cepa microbiana y medios de cultivo. Para estos estudios previos se va a partir de cultivos puros, aunque se pretende extender los estudios a cultivos mixtos. Figura 11: Esquema obtención microorganismos halófilos

50. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 49 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Figura 22: Cultivos al 4% de carbohidratos antes del cosechado Se establece que la biomasa producida, que es una variable dependiente de la concentración inicial del microorganismo, de la tasa de crecimiento ( μ ) y del tiempo, se medirá por turbidimetría midiendo la densidad óptima a 600nm. Para poder relacionar las medidas espectrofotométricas con la concentración real de biomasa en el cultivo (Cell Dry Weight, CDW, g/L) se elaborará una recta de calibrado, a partir de muestras de volumen y contenido en biomasa conocidos. Comparando con las tasas de crecimiento de los datos bibliográficos (Tabla 14), la condición 1% que presenta una tasa de 0,0555 (h-1) es comparable con las tasas de crecimiento de las ratios C/N de 8 y de 17, ya que estas presentan las mismas tasas de crecimiento 0,054. Para la otra condición de 2%, cuya tasa de crecimiento es 0,0446 (h-1), es solamente comparable con la ratio C/N de 42, que presenta una tasa de 0,046. La última condición de 4%, cuya tasa es de 0,0536 (h-1), se puede comparar con la ratio C/N de 25 que es 0,053, aunque también se puede comparar con las mismas ratios que la condición de 1%, ya que en su tasa de crecimiento se encuentra entre estas tres ratios. Todo esto indica que nuestro cultivo presenta un estrés similar a estas condiciones. Sin embargo, no hay una linealidad clara, haciendo que esto sea dudoso. En el caso hipotético de que nos dé una productividad similar obtendríamos en torno a 0,65 g/l, ya que Ferre y James obtuvieron una producción muy similar entre estas 3 condiciones. En esta comparación hemos podido concluir que nuestros resultados no están separados de los que aparecen en la bibliografía. Esto supone un buen indicio para continuar el estudio. Además, se puede apreciar que hemos recopilado nueva información que no aparecen en la documentación bibliográfica. Una vez que el cultivo llega a la fase estacionaría, se han centrifugado a 16000 rpm durante 20 minutos (Centrifuge 5430 R, Eppendorf) para separar el pellet del sobrenadante, el cual se pasa a un tubo falcón estéril para los balances de materia. El pellet se lavaba con ag ua de sales al 25%, retirando el sobrenadante, resuspendiendo el pellet y volviendo a centrifugar (Figura 22). De esta forma se retiran todos los posibles restos de medio que han podido quedar. Para quitar el agua de los lavados, se volvía a centrifugar a 20 minutos a 16000 rpm. Posteriormente, el cultivo permanecía en el tubo falcón en una cámara de frío (temperatura de la cámara fría) hasta el día de su extracción (Figura 23). Figura 21: Cultivos al 2% de carbohidratos antes del cosechado

55. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 54 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Para los siguientes estudios experimentales se descarta por completo este método de esterilización y convierte a la filtración en la mejor opción. Además, de las tres longitudes de ondas que se han empleado para monitorizar el crecimiento, la mejor es la de 600 nm por su estabilidad durante todo el cultivo. 2.2.5. Producción de PHA Una vez alcanzado el máximo de crecimiento para una cantidad de carbohidratos determinada, se continúa el bioproceso con escasez de fuente de fósforo, para inducir que las arqueas produzcan PHA, esta etapa durará entre 72 y 80 horas, monitorizando la evolución en el crecimiento de los microorganismos y la evolución en la concentración de los nutrientes , fuentes d e C, N y P. Se van a realizar los siguientes estudios: • Estudio del tiempo de fermentación con el fin de determinar el tiempo óptimo requerido para alcanzar el mayor número de células microbianas con gránulos. Se analizará la evolución temporal de la productividad, la biomasa y el rendimiento. • Estudio de la temperatura óptima de operación. Normalmente los microorganismos halófilos crecen a temperatura más elevadas (óptimo alrededor de 42 ° C) que el resto de microorganismos mesófilos. Se compararán dos temperaturas de crecimiento y se analizará la productividad la biomasa y el rendimiento. • Estudio de la velocidad de agitación. La agitación tiene efect o directo sobre la disponibilidad de oxígeno por parte del cultivo, ya que potencia su dispersión en el medio, renueva a mayor velocidad el flujo transferido al caldo desde la fase gaseosa y por tanto, mejora la accesibilidad de las células. Afecta tanto a crecimiento como al metabolismo microbiano, pudiendo influir negativamente en el rendimiento y la viabilidad de los procesos biotecnológicos. Se compararán dos velocidades de agitación y se analizará la productividad la biomasa y el rendimiento. • Estudio del modo de producción/operación: continuo (fed-batch) o en discontinuo (batch), en una etapa o en dos etapas. Estos bioprocesos se realizan con automatizado para el control de oxígeno disuelto, pH, temperatura, con adición automática.

40. La mayoría de microorganismos halófilos descritos son capaces de producir el copolímero PHBHV 38 , PHA objetivo del proceso por presentar mejores propiedades mecánicas y más flexibilidad que el homopolímero PHB. Al aumentar el porcentaje de la fracción HV aumenta la flexibilidad del material y disminuye su cristalinidad. En la bibliografía está descrito que determinados microorganismos halófilos, en presencia de carbohidratos simples como glucosa o galactosa (como los derivados de la industria de las golosinas), producen el copoliester PHBHV a diferencia del resto de bacterias, que producen el homopoliester PHB y por ello, no necesitan un aporte externo de precursores directos del 3HV como es el ácido propiónico, ácido valérico o ácido levulínico (Tabla 9). Estos precursores son mucho más caros que la glucosa y los carbohidratos, contribuyendo considerablemente a los altos costos de la producción de PHBHV. 38 Koller, M. (2019). Polyhydroxyalkanoate biosynthesis at the edge of water activitiy-haloarchaea as biopolyester factories. Bioengineering, 6(2), 34. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 39 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución 2. DISEÑO E IMPLEMENTACIÓN DEL SISTEMA PILOTO El sistema piloto de producción de PHA se va a basar en la combinación de dos estrategias: uso de residuos sólidos y aguas efluentes de la industria de las golosinas como fuentes de carbono y su transformación en PHAs por microorganismos halófilos. Esta estrategia de bioproceso permitirá ahorrar costos en el proceso de producción de PHA por diferentes razones: 1. Reducción de costos de materias primas al utilizar residuos de la industria agroalimentaria 2. Reducción de costos de pretratamientos, al usar residuos ricos en azúcares simples y precursoresdirectos de los PHAs 3. Reducción de energía necesaria para los procesos de esterilización al utilizar altas concentracionesde sal 4. Altos rendimientos de conversión del sustrato a PHAs al emplear microorganismos resistentes a parámetros fluctuantes durante la fermentación (pH, oxigenación y temperatura) 1. Microorganismos productores de copolímeros de PHBHV, incluso sin presencia de precursores directos de 3HV 2. Utilización de biorreactores de plástico totalmente equipados para la monitorización remota del bioproceso y su control, que necesitan menos inversión de capital que los biorreactores de acero inoxidable 3. Eficiencia del proceso downstream (extracción y purificación), pues la recuperación de PHAs se puede conseguir por choque osmótico con agua dulce. Desde el punto de visto científico-tecnológico, los resultados derivados del desarrollo de este proceso piloto van a sentar las bases de proceso a aplicar con el fin de facilitar la futuraimplementación a escala industrial

34. Figura 8: Ruta metabólica de aprovechamiento energético de los azúcares Como el residuo seleccionado presenta altos contenidos de glucosa como fuente de carbono, la ruta metabólica de aprovechamiento energético de los azúcares utiliza tres enzimas en secuencia1 24 , PhaA (_ cetotiolasa) que provoca la condensación de una molécula de acetil-CoA en una de aceto-acetil CoA, PhaB (hidrolasa o acetoacetilCoA reductasa-NADPH dependiente, enzima que provoca mediante la pérdida de una molécula de agua la formación de (R)3-hidroxiacilCoA al incorporar un radical OH, y por último, la enzima PhaC (polimerasa) o poli(3-hidroxibutirato) sintetasa que une las cadenas de (R)3- hidroxiacilCoA sintetizados (Figura 5). 24 Cerrone, F. (2011). Producción de poliésteres biopoliméricos (PHAs) desde alpeorujo por medio de bacterias fijadoras de nitrógeno. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 33 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Entre los organismos asimiladores de glucosa o fructosa y productores de copolímeros P(3HB-co-4HB), P(3HB- co-3HV) se encuentran: Ralstonia eutropha, Alcaligenes latus y Cupriadivus necator o C.acidovorans son capaces de sintetizar copolímeros de 3-hidroxibutirato y 4-hidroxibutirato cuando crecen en medios con ácido 4-hidroxibutírico, 1,4-butano-diol, butirolactona o ácido 4-clorobutírico. Gamma butirolatona. Halomonas bluephagenesis1 TD40 bajo condiciones de no esteriliza ción, y producción de P(3HB-co-4HB) en FED-BATCH (lote alimentado) , añadiendo _-butyrolactone como precursor. Se han encontrado polímeros que contienen monómeros de 4-hidroxivalerato en bacterias del género Ralstonia eutropha y de la cepa de Pseudomonas oxalaticus.

2. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 01 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución ÍNDICE 1 SELECCIÓN DE RESIDUOS Y MICROORGANISMOS ÓPTIMOS PARA LA PRODUCCIÓN DE PHA 03 1.1 Revisión bibliográfica 03 1.2 Tarea 1.1. Determinación de PHAs objetivo 11 1.3 Tarea 1.2. Estudio de los residuos agroalimentarios de la Región de Murcia y selección preliminar. 14 1.4 Tarea 1.3. Estudio y selección de los cultivos de microorganismos óptimos para el proceso. 27 1.4.1. Microorganismos extremófilos 35 2 DISEÑO E IMPLEMENTACIÓN DEL SISTEMA PILOTO 39 2.1 Tarea 2.1. Pretratamiento de residuos 40 2.2 Tarea 2.2. Obtención del PHA a escala laboratorio y validación. 42 2.2.1. Cepa microbiana y medios de cultivo. 42 2.2.2. Condiciones de cultivo 45 2.2.3. Seguimiento del crecimiento del cultivo y cosechado 45 2.2.4. Diseño experimental para la extracción de PHA 49 2.2.5. Producción de PHA 54 3 BIBLIOGRAFÍA 55 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1: Monómeros formadores de PHAs 12 Tabla 2: Propiedades mecánicas de copolímeros de P(3HB-co-3HV) y P(3HB-co-4HB) 13 Tabla 3: Principales variables de la industria agroalimentaria-Región de Murcia CREM 2017 19 Tabla 4: Macromagnitudes Industria Alimentaria -Centro Regional de Estadística de Murcia 20 Tabla 5: Consumo de agua por actividad agroalimentaria4 21 Tabla 6: Información nutricional de los residuos de golosinas 27 Tabla 7: Resumen de características de producción de PHA con diferentes microorganismos 30 Tabla 8: Microorganismos y su nutriente limitante en la producción de PHA 32 Tabla 9: Microorganismos extremófilos productores de PHAs 37 Tabla 10: Ventajas del uso de microorganismos halófilos en procesos biotecnológicos 38 Tabla 11: Valor nutricional del residuo golosina de mora. Fuente: Empresa de golosinas de Murcia 44 Tabla 12: Densidades ópticas alcanzadas por todos los cultivos y sus tasas de crecimiento 47 Tabla 13: Tasas de crecimiento obtenidas por bibliografía 48 Tabla 14: Metodologías y sus rendimientos en distintos estudios 51 Tabla 15: Metodologías empleadas en la bibliografía para la extracción de PHA 52

25. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 24 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Los residuos derivados de la obtención del aceite de oliva, como el alpeorujo y el alpechín también han sido muy utilizados en la bibliografía para la producción de PHAs. España es el mayor productor de aceite de oliva (33%) de la Unión Europea y parte de esta producción se concentra en las zonas del Levante, que se extiende en las provincias de Murcia, Alicante y Valencia, donde la olivicultura cuenta con una extensión de 75000Ha de olivares, cultivando variedades como la Blanqueta, Villalonga, Lechín y Cornicabra. En la Región de Murcia contamos con un sector importante de la olivicultura, representado por aceites como los procedentes de los Valles de Ricote. A pesar de que estos desechos son muy ricos en carbohidratos y ácidos grasos, también contienen altos porcentajes de sustancias tóxicas como polifenoles y además poseen un contenido muy elevado en lignina, en torno al 20-47%. Por tanto el alpeorujo es un residuo bastante complejo, que necesita de un pretratamiento previo para poder ser utilizado por las bacterias productoras de PHA. Normalmente se necesita una digestión anaerobia con una fase acidogénica para que los microorganismos acidogénicos generen ácidos grasos volátiles (VFAs), que puedan ser utilizados como precursores de los PHAs y por lo tanto, supone un aumento de los costes del proceso. Existe una creciente investigación en el uso de residuos urbanos de estaciones de depuración de aguas residuales (EDAR), que se está interesando por la recuperación de esta materia orgánica para su uso como materia prima en la fabricación de bioplásticos a través de cult ivos mixtos en las propias plantas depuradoras, impulsando así un modelo de economía circular donde los residuos son considerados como recursos para otros usos. Estos residuos son abundantes durante todo el año, son ricos en materia orgánica, aunque necesitan de un tratamiento para transformarlos en fuentes de carbono precursoras de la síntesis de PHA, que se puede acoplar in situ en la planta de depuración durante el propio tratamiento secundario y anaerobio de los lodos generados. Países pioneros como Alemania o Suecia ya cuentan con plantas piloto donde se está acoplando la producción de PHA al tratamiento de residuos de estaciones depuradoras de aguas residuales 15,16 . La Región de Murcia cuenta con 93 EDAR distribuidas por toda la Región con un volumen anual de depurado de 105 Hm3/año 17 , con potencial de convertirse en posibles biorefinerías para la producción de PHAs. Sin embargo, estas aguas residuales además de ser ricas en materia orgánica presentan un gran grado de contaminación proveniente tanto de efluentes industriales como de productos y preparados domésticos tales como productos de limpieza del hogar, productos higiénicos y cosméticos, aditivos, medicamentos, antibióticos y fármacos o productos empleados en jardinería como biopesticidas, compuestos organometálicos, incluyendo drogas de abuso. Estos contaminantes pueden incorporarse a los lodos de depuración generados en las EDAR, y dado que la mayoría de las EDAR españolas operan mediante sistemas biológicos, estos 15 Morgan-Sagastume, F., Valentino, F., Hjort, M., Cirne, D., Karabegovic, L., Gerardin, F., ... & Bengtsson, S. (2014). Polyhydroxyalkanoate (PHA) production from sludge and municipal wastewater treatment. Water science and technology, 69(1), 177-184. 16 Pittmann, T., & Steinmetz, H. (2017). Polyhydroxyalkanoate production on waste water treatment plants: Process scheme, operating conditions and potential analysis for German and European municipal waste water treatment plants. Bioengineering, 4(2), 54. 17 http://www.esamur.com/mapa-de-edar

46. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 45 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución 2.2.2. Condiciones de cultivo Los cultivos se han incubado a 42oC a 170 rpm en un bioreactor (Figura 15) durante el tiempo que tarda el cultivo en llegar a la fase estacionaria. Figura 15: Bioreactor de laboratorio con control de temperatura, agitación, pH y adición de nutrientes 2.2.3. Seguimiento del crecimiento del cultivo y cosechado El crecimiento de los microorganismos se monitorizó mediante la curva absorbancia frente al tiempo a tres longitudes de onda, 520, 550 y 600 nm utilizando el espectrofotómetro (Cary 60 UV-Vis, Agilent Technologies). Estas tres longitudes de ondas fueron escogidas debido a que a la bacteriorruberina causa interferencias en las medias de absorbancia. Este pigmento se mide mediante un barrido de absorbancia desde los 300 a los 600 nm, de modo que tiene un pico en los 520 , lo que ta mbién ha supuesto que algunos autores sigan su crecimiento con esta longitud de onda . Además, otros autores siguen el crecimiento a 600 nm , . Las medidas a 550 nm son para tener una referencia intermedia entre las otras dos longitudes de onda. La Figura 16,Figura 17 y Figura 18 y Tabla 12 muestran la evolución de crecimiento de las arqueas para concentraciones de carbohidratos de 1%, 2% y 4%. 39 Kusmita, L., Mutiara, E. V., Nuryadi, H., Pratama, P. A., Wiguna, A. S., & Radjasa, O. K. (2017). Characterization of carotenoid pigments from bacterial symbionts of soft-coral Sarcophyton sp. from North Java Sea. International Aquatic Research, 9(1), 61-69. 40 Biosynthesis and Characterization of Polyhydroxyalkanoates with Controlled Composition and Microstructure 41 Production of polyhydroxyalkanoates from inexpensive extruded rice bran and starch by Haloferax mediterranei 42 Alsafadi, D., & Al-Mashaqbeh, O. (2017). A one-stage cultivat ion process for the production of poly-3-(hydroxybutyrate-co- hydroxyvalerate) from olive mill wastewater by Haloferax mediterranei. New biotechnology, 34, 47-53. 43 Ferre-Guell, A., & Winterburn, J. (2018). Biosynthesis and characterization of polyhydroxyalkanoates with controlled composition and microstructure. Biomacromolecules, 19(3), 996-1005.

16. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 15 Las corrientes de residuos más prometedoras en cuanto a su uso como fuente de carbono en la producción de PHA son: 1. Residuos industriales agroalimentarios : Han sido los residuos más utilizados y esto se debe a la gran disponibilidad y amplia variedad de recursos (desde residuos sólidos a aguas residuales industriales). Estos residuos incluyen: residuos sólidos vegetales (salvado de arroz, cáscaras de guisantes, raíces de achicoria, piel de patata, orujo de manzana, piel de cebolla), orujo de uva, residuos de granja animal, residuos avícolas, aguas residuales industriales de procesos de extracción de aceite de oliva, de la industria cervecera, de procesado de frutas y verduras, suero de leche de la industria de queso, y destilado de aceite de oliva. El suero lácteo es el residuo con más referencias. Los excedentes de suero lácteo son abundantes diariamente y la industria del queso constituye un residuo y material excedente en muchas regiones del mundo. Por cada 10 kg de queso producido se generan 90 Kg de suero láctico, siendo la cantidad de suero producido mundialmente de alrededor de 1,25 x 108 toneladas al año. La lactosa, el carbohidrato mayoritario del suero, puede servir como fuente de carbono para la producción biotecnológica de PHA. Sin embargo, solo un número de microorganismos puede convertir la lactosa en PHAs directamente. Algunos reportados son Alcaligenes latus, Hydrogenophaga pseudoflava y algunas cepas de bacterias modificadas genéticamente como cepas recombinantes de Escherichia coli, en las cuales se han incorporado los genes de Alcaligenes latus implicados en la producción de PHAs 6 . Alternativamente, si los microorganismos carecen de esta actividad enzimática o la actividad enzimática de la b-galactosidasa no es elevada, la lactosa puede ser hidrolizada enzimáticamente o químicamente a glucosa y galactosa. Así por ejemplo utilizando lactosa hidrolizada, microorganismos como Ralstonia eutropha o Haloferax mediterranei pueden producir PHAs. Otra posibilidad, un poco más compleja sería la conversión anaerobia de la lactosa a ácido láctico primero usando Lactobacillus y posteriormente en otro paso de fermentación aerobia el ácido láctico sería metabolizado a acetil-CoA y después a PHA. Figura 3: Residuos más utilizados como fuente de carbono para l a producción de PHAs 6 Koller, M., Atli_, A., Dias, M., Reiterer, A., & Braunegg, G. (2010). Microbial PHA production from waste raw materials. In Plastics from bacteria (pp. 85-119). Springer, Berlin, Heidelberg.

29. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 28 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Figura 6: Gránulos de PHA intracelulares A la hora de seleccionar los microorganismos, se puede partir de una cepa cultivada o cultivos puros o partir de cultivos mixtos o cepas salvajes, obtenida de suelos, lodos, etc (Figura 7). Un cultivo puro es aquel que está compuesto por un solo tipo de microorganismos. Este tipo de cultivo surge a partir de colonias aisladas, de manera que todos los individuo s del mismo presenten la misma composición genética. Un cultivo mixto es una población bacteriana de microorganismos de composición no definida y estructura determinada por las condiciones operacionales impuestas al sistema biológico. Las condiciones operacionales impuestas ejercerán una selección natural en los microorganismos permitiendo obtener una población capaz de efectuar transformaciones específicas de componentes intra y extracelulares. La selección de un cultivo mixto productor de PHA viene dado por la imposición de condiciones que limitan el metabolismo primario. Se sabe que los cultivos mixtos presentes en sistemas de tratamiento de aguas pueden acumular PHAs. Esta acumulación de PHA por cultivos mixtos cobra una gran importancia en aquellos sistemas de tratamiento en los que se experimentan condiciones variables de disponibilidad de algunos nutrientes como pueden ser el carbono y/o el oxígeno 20 . Actualmente existe una creciente línea de investigación en el uso de cultivos mixtos productores de PHAs asociados a las estaciones de depuración de aguas residuales, como una solución de cara a economizar el proceso de producción utilizando como fuentes de carbono la materia orgánica presente en los lodos de la depuradora 21 . 20 Serafim, L. S., Lemos, P. C., Albuquerque, M. G., & Reis, M. A. (2008). Strategies for PHA production by mixed cultures and renewable waste materials. Applied microbiology and biotechnology, 81(4), 615-628. 21 Pittmann, T., & Steinmetz, H. (2017). Polyhydroxyalkanoate production on waste water treatment plants: Process scheme, operating conditions and potential analysis for German and European municipal waste water treatment plants. Bioengineering, 4(2), 54.

30. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 29 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Figura 7: Rutas para la obtención de PHAs Las colecciones de cultivos están generalmente bien documentadas en términos de la genética y bioquímica que está detrás de la asimilación de carbono y acumulación de PH A. Este conocimiento, permite la selección de los microbios apropiados de acuerdo con la fuente de carbono objetivo, facilitando el inicio rápido de investigaciones relacionadas con PHA y / o su producción industrial. La Tabla 7 22 proporciona un resumen de sustratos de carbono utilizados en la producción de PHA por deposito de cepas bacterianas y arqueas 3 . 22 Blunt, W., Levin, D., & Cicek, N. (2018). Bioreactor operating strategies for improved polyhydroxyalkanoate (pha) productivity. Polymers, 10(11), 1197.

15. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 14 El tipo de PHAs que se quiere producir debe tener la suficiente flexibilidad como para poder ser utilizado para la fabricación de envase flexible (film y lámina) , por lo que las condiciones del proceso deben orientarse a la obtención de un P3HB copolímero, de manera que el tipo y proporción del otro monómero proporcione unas propiedades de resistencia mecánica similares a las de una poliolefina (polietileno o polipropileno). 1.3 Tarea 1.2. Estudio de los residuos agroalimentarios de la Región de Murcia y selección preliminar. Los PHAs comerciales tienen un alto coste en comparación con los polímeros convencionales, fundamentalmente debido a las materias primas que usan como fuen te de carbono. Alrededor del 50% de los costes totales de producción de PHA se deben a las materias primas, lo que conlleva altos costes de producción. Adicionalmente, la industria del PHA ha generado preocupaciones puesto que la mayoría de PHAs se producen principalmente a partir de cultivos alimenticios (cereales), caña de azúcar y aceites vegetales. La producción de estas fuente de carbono compite con la producción de alimentos para consumo humano o animal. Por ejemplo, cuando el maíz se usa como fuente de glucosa, a partir de 1 kg de maíz se producen 0,67 kg de glucosa, y con esta cantidad de glucosa se puede producir 0,27 kg de PHA. En consencuencia para producir 34.000 toneladas de PHA se necesitarían 126.000 toneladas de maíz. Por lo tanto, lo recomendable es elegir sustratos baratos, fácilmente disponibles y renovables, que no compitan con la producción de alimentos para consumo humano y que a su vez apoyen el crecimiento microbiano de manera eficiente. Es por ello que existe una gran tendencia en la investigación de PHAs obtenidos a partir de residuos como fuentes de carbono 4 . Las principales rutas de producción de PHA identificadas en la bibliografía usan azúcares o ácidos grasos como fuente de carbono siendo éstos los mejores candidatos para ser usados como fuente de carbono para fabricar PHA. Por residuos azúcares entendemos residuos ricos en carbohidratos simples como glucosa, fructosa, sacarosa y por residuos grasos entendemos residuos con altos contenidos en ácidos grasos como ácido palmítico, esteárico, oleico, linoleico, butírico, acético o propiónico. Otros residuos con alta cantidad de materia orgánica que pueden ser transformados en fuente de carbono mediante tratamientos biológicos o físico-químicos son los carbohidratos complejos o ácidos graso s volátiles como acetato, propionato, butirato o lactato 5 . En la Figura 3 se muestran los porcentajes de referencias desde 2015 a 2017 de los residuos más utilizados como fuentes de carbono en los estudios de producción de PHA. 4 Rodriguez-Perez, S., Serrano, A., Pantión, A. A., & Alonso-Fariñas, B. (2018). Challenges of scaling-up PHA production from waste streams. A review. Journal of environmental management, 205, 215-230. 5 Gómez Cardozo, J. R., Mora Martínez, A. L., Yepes Pérez, M., & Correa Londoño, G. A. (2016). Production and characterization of polyhydroxyalkanoates and native microorganisms synthesized from fatty waste. International journal of polymer science, 2016.

37. Actualmente, ha crecido el interés por estos organismos, debido a sus características genéticas, bioquímicas, fisiológicas y evolutivas únicas. Para hacer frente a las extremas condiciones de su hábitat, los extremófilos han desarrollado diversas estrategias tanto a nivel intracelular como extracelular, que comprenden la biosíntesis de productos singulares para la protección de la célula, y de macromoléculas biológicas como enzimas y polímeros extracelulares que, en conjunto, les ofrecen ventajas para su desarrollo. La gran biodiversidad existente entre los microorganismos extremófilos y su capacidad para sintetizar proteínas y enzimas, capaces de funcionar bajo condiciones extremas, ha abierto un prometedor panorama en la biotecnología, ya que gran parte de los procesos industriales ocurren bajo condiciones extremas de temperatura, presión, fuerza iónica, pH y solventes orgánicos. Un ejemplo concreto de aplicación biotecnológica de un organismo termófilo es la bacteria Thermus aquaticus, que crece a temperaturas mayores de 70 ° C y una de sus enzimas termoestables (en concreto la ADN polimerasa) es ampliamente utilizada en biotecnología para replicar el ADN en la reacción de PCR (Polymerase Chain Reaction). Otro ejemplo de aplicaciones de enzimas alcalófilas es en la industri a de los detergentes, como las proteasas alcalinas producidas a partir de cepas bacterianas de Bacillus alcalófilos. Los microorganismos halófilos constituyen un grupo versátil filogenéticamente (bacterias grampositivas, bacterias gramnegativas y arqueas) que normalmente viven en hábitats salinos, como salinas, lagos y suelos salinos, capaces de crecer hasta en concentraciones de 30% de sal. Han demostrado ser un grupo de extremófilos con un gran potencial biotecnológico, debido a que producen compuestos de enorme interés industrial, como enzimas, biopolímeros o solutos compatibles 26,27 . Así por ejemplo, es el caso de la presencia de solutos compatibles, compuestos osmoprotectores y con poder estabilizador de interés en la industria alimentaria, la biodegradación de residuos hipersalinos como los que se generan en numerosos procesos industriales o el uso de enzimas halófilas como las que se requieren en la industria del cuero y las pieles. Además biopolímeros de gran interés biotecnológico en la industria farmaceútica o alimentaria son los biopolímeros extracelulares de diversos microorganismos extremófilos, como el poli-gamma-D-glutámico (PGA) con propiedades de espesante y humectante, o la capa S de las Arqueas, que contiene una glicoproteína situada en la parte exterior de la célula y que tiene la propiedad de autoensamblarse, formando una malla altamente regular, que ha despertado gran interés en la nanotecnología. Otro grupo importante de biopolímeros son los exopolisacáridos (EPS), compuestos de alto peso molecular que los microorganismos secretan al medio ambiente y que pueden actuar como adhesinas favoreciendo la asociación entre microorganismos. Estas biomoléculas son utilizadas en diversas áreas industriales, ya que pueden actuar como emulsificantes, espesantes, antioxidantes y quelantes. En lo concerniente al desarrollo alternativo de los plásticos y de nuevas aplicaciones en el campo de la biomedicina, la producción de PHAs por parte de microorganismos extremófilos y halófilos no ha sido muy 26 Deepalaxmi, R. K., & Gayathri, C. (2018). Screening of bioactive compound, antimicrobial activity producing halophilic isolates from the saltpans of Thoothukudi district. African Journal of Microbiology Research, 12(15), 338-344. 27 Liu, C., Baffoe, D. K., Zhan, Y., Zhang, M., Li, Y., & Zhang, G. (2019). Halophile, an essential platform for bioproduction. Journal of microbiological methods, 166, 105704. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 36 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución

28. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 27 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Se han analizado los diferentes residuos para determinar su composición nutricional (Tabla 6). Se trata de residuos con un elevado contenido en azúcares como sustitutos de la glucosa, con el fin de abaratar el proceso de fabricación de PHA. Tabla 6: Información nutricional de los residuos de golosinas 19 González García, Y., CONTRERAS, M., Carlos, J., GONZÁLEZ REYNOSO, O., & CÓRDOVA LÓPEZ, J. A. (2013). Síntesis y biodegradación de polihidroxialcanoatos: plásticos de origen microbiano. Revista internacional de contaminación ambiental, 29(1), 77-115. 1.4 Tarea 1.3. Estudio y selección de los cultivos de microorganismos óptimos para el proceso. Los PHA son polímeros de ácidos hidroxialcanoicos que algunas bacterias, arqueas y microalgas acumulan intracelularmente como material de reserva, para usarlo posteriormente como fuente de carbono y energía. La bioacumulación de PHA está muy extendido entre más de 70 especies de microbios del género de las bacterias y las arqueas, el PHA se almacena en forma de gránulos lipídicos intracelulares 19 (Figura 6). La polimerización de los ácidos hidroxialcanoicos, por acción de enzimas intracelulares, tiene lugar mediante condensación del grupo carboxilo de un monómero (ácido hidroxialcanoico), con el grupo hidroxilo del siguiente, formándose un enlace éster de allí que también se les conozca como biopoliésteres. Se acumulan como polímeros líquidos, móviles y amorfos en forma de gránulos que se alojan en el citoplasma microbiano rodeados de una monocapa de fosfolípidos que contiene enzimas polimerasas y despolimerasas. Las investigaciones sobre el proceso de acumulación de PHA indican que el número de gránulos por célula se define en las primeras etapas de acumulación y que la producción del polímero cesa cuando su contenido alcanza cerca del 80 % del peso celular en base seca. Este fenómeno ha llevado a la conclusión de que existen restricciones físicas que impiden a la célula acumular más polímero, a pesar de la disponibilidad de sustrato y actividad de la enzima PHA polimerasa 3

18. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 17 con un porcentaje de acumulación de PHA del 54.6% 12 . Otros residuos generados durante el proceso de extracción del aceite de oliva, como el orujo y el alpechín, altamente contaminantes debido a su alta carga orgánica y contenido en compuestos fenólicos también han sido utilizados para la producción de PHAs en bacterias como Pseudomonas putida KT2442 o Azotobacter c hroococcum H23 13 . Otros residuos analizados han sido el orujo de uva y mezclas de residuos sólidos alimentarios. Para que el proceso sea viable se debe conseguir alcanzar un método de recolección de los residuos eficiente y económicamente sostenible. 4. Residuos urbanos de plantas de tratamiento. Incluyen fuentes de carbono de residuos sólidos municipales y plantas de tratamiento de aguas: lodos, fracción orgánica de los lixiviados de residuos sólidos, lodos combinados con la fracción orgánica. Hay una creciente investigación enfocada a la integración de la producción de PHA en las plantas de tratamiento de residuos. La mayoría de los estudios se centran en el empleo de aguas residuales y lodos activos como fuente de carbono. Las aguas residuales contienen fundamentalmente materia orgánica, además de un gran número de partículas de distintos tamaños que obliga a establecer diferentes actuaciones sobre el agua en las EDAR (Figura 4). 12 Fernández, D., Rodríguez, E., Bassas, M., Viñas, M., Solanas, A. M., Llorens, J., ... & Manresa, A. (2005). Agro-industrial oily wastes as substrates for PHA production by the new strain Pseudomonas aeruginosa NCIB 40045: Effect of culture conditions. Biochemical engineering journal, 26(2-3), 159-167. 13 Garcia Ribera, R., Monteoliva-Sanchez, M., & Ramos-Cormenzana, A. (2001). Production of polyhidroxyalkanoates by Pseudomonas putida KT2442 harboring pSK2665 in wastewater from olive oil mills (alpechín). Electronic Journal of Biotechnology, 4(2), 116-119. Figura 4: Esquema del proceso de depuración de aguas residuales

14. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 13 Cuanto mayor es la elasticidad del material, mayor es el valor d e esta deformación. El módulo de elasticidad o módulo de Young (E) se define como el cociente entre el esfuerzo y la deformación que produce 2 : donde Ω ‚ es el esfuerzo ejercido sobre el área transversal del material , , y es la relación entre el aumento de la longitud del material y la longitud inicial, Cuanto mayor es el valor del módulo de elasticidad, más rígido es el material y más se resiste a la deformación, el material es menos elástico. El alargamiento de rotura es el % de deformación que sufre el material en tracción cuando se produce su rotura, y será mayor cuanto mayor sea la elasticidad del material y menor su rigidez. El P3HB es relativamente frágil (el alargamiento a la rotura generalmente por debajo del 15%) y rígido (el módulo E está por encima de 1 Gpa). La incorporación de los monó meros 3HV , 4HB y 3HHx en la cadena de P3HB, disminuye la cristalinidad del polímero, temperatura de fusión y temperatura de transición vítrea, con la consecuente disminución de la fragilidad y rigidez del po límero y aumento de su flexibilidad. La Tabla 2 muestra las propiedades mecánicas de P3HB comonómero con 3HV y 4HB, donde se observa el aumento de la flexibilidad del PHA al aumentar la cantidad de estos dos monómeros en la cadena del polímero 3 . 2 Foreman, J., Gill, P. S., & Sauerbrunn, S. R. (2016). Tensile Modulus of Plastic Films. 3 Li, Z. J., Shi, Z. Y., Jian, J., Guo, Y. Y., Wu, Q., & Chen, G. Q. (2010). Production of poly (3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) from unrelated carbon sources by metabolically engineered Escherichia coli. Metabolic engineering, 12(4), 352-359. Tabla 02 Propiedades mecánicas de copolímeros de P(3HB-co-3HV) y P(3HB-co-4HB) Figura 01: Tracción Figura 02: Deformación en tracción

38. Tabla 9: Microorganismos extremófilos productores de PHAs 30 31 32 33 34 35 36 37 explorada hasta la fecha, a pesar de que algunos de ellos son capaces de acumular hasta el 75 % del peso seco de polihidroxialcanoatos (PHAs) 28,29 . En la Tabla 9 se muestra una lista de algunos microorganismos extremófilos productores de PHAs. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 37 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución 28 Koller, M. (2017). Production of polyhydroxyalkanoate (PHA) biopolyesters by extremophiles. MOJ Polym Sci, 1(2), 1-19. 29 Vásquez, F., Idrogo III, E., & Carreño Farfán, C. R. (2018). Rendimiento de polihidroxialcanoatos (PHA) en microorganismos halófilos aislados de salinas. Revista peruana de biología, 25(2), 153-160. 30 Yue, H., Ling, C., Yang, T., Chen, X., Chen, Y., Deng, H., ... & Chen, G. Q. (2014). A seawater-based open and continuous process for polyhydroxyalkanoates production by recombinant Halomonas campaniensis LS21 grown in mixed substrates. Biotechnology for biofuels, 7(1), 108. 31 Tan, D., Wu, Q., Chen, J. C., & Chen, G. Q. (2014). Engineering Halomonas TD01 for the low-cost production of polyhydroxyalkanoates. Metabolic engineering, 26, 34-47. 32 Koller, M., Chiellini, E., & Braunegg, G. (2015). Study on the Production and Re-use of Poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) and Extracellular Polysaccharide by the Archaeon Haloferax mediterranei Strain DSM 1411. Chemical and biochemical engineering quarterly, 29(2), 87-98 33 Danis, O., Ogan, A., Tatlican, P., Attar, A., Cakmakci, E., Mertoglu, B., & Birbir, M. (2015). Preparation of poly (3-hydroxybutyrate-co- hydroxyvalerate) films from halophilic archaea and their potential use in drug delivery. Extremophiles, 19(2), 515-524. 34 Ibrahim, M. H., & Steinbüchel, A. (2010). High-cell-density c yclic fed-batch fermentation of a poly (3-hydroxybutyrate)-accumulating thermophile, Chelatococcus sp. strain MW10. Applied and environmental microbiology, 76(23), 7890-7895. 35 Di Donato, P., Fiorentino, G., Anzelmo, G., Tommonaro, G., Nicolaus, B., & Poli, A. (2011). Re-use of vegetable wastes as cheap substrates for extremophile biomass production. Waste and Biomass Valorization, 2(2), 103-111. 36 Legat, A., Gruber, C., Zangger, K., Wanner, G., & Stan-Lotter, H. (2010). Identification of polyhydroxyalkanoates in Halococcus and other haloarchaeal species. Applied Microbiology and Biotechnology, 87(3), 1119-1127. 37 Salgaonkar, B. B., & Bragança, J. M. (2015). Biosynthesis of poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) by Halogeometricum borinquense strain E3. International journal of biological macromolecules, 78, 339-346.

17. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente BIOPLASMUR - Memoria de ejecución Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 16 Los residuos de las aguas residuales industriales han sido otro de los residuos más empleados para producir PHAs (aguas de la industria conservera, cárnica, agroalimentaria, aguas residuales de la fabricación de almidón y del queso) 7,8 . 2. Residuos industriales no agroalimentarios. Los estudios se centran en los residuos derivados de la fabricación de biodiesel que tienen una alta concentración de glicerol, ácidos grasos procedentes de la purificación del glicerol y ácidos carboxílicos. El componente mayoritario generado en la producción de biodiesel es el glicerol, por 1 kg de biodiesel se producen más de 100 g de glicerol como subproducto de la llamada fase líquida 9 . El uso de residuos como el aceite de cocina, las grasas sobrantes en restaurantes o derivados del jabón son materias primas rentables para la producción de biodiesel. La integración de la producción de PHA en la propia industria de producción de biodiesel supondría una gran reducción en los costes de producción de ambos procesos. Algunos estudios han reportado que el uso de glicerol como fuente de carbono disminuye el peso molecular del PHA producido en microorganismos como Pseudomonas oleovorans y Haloferax mediterranei 10 . Este hecho puede ser explicado debido a que cuando el glicerol y otros glicoles están presentes en el medio, estas sustancias causan la terminación de la cadena en crecimiento uniéndose covalentemente al extremo carboxilo del poliester ('endcapping’) 11 . Este hecho es de gran importancia en la calidad del final del PHA, puesto que tendrá un peso molecular inferior. Por tanto, si se usa glicerol como fuente de carbono habrá que considerar los pesos moleculares de los PHAs obtenidos puesto que en algunos casos tendrán poca fuerza en fundido para su posterior extrusión. 3. Residuos alimentarios. Los residuos alimentarios incluyen: residuos sólidos (granos de gafé, arroz, vegetales cocinados y no cocinados, pieles de frutas y vegetales, carnes cocinadas) y residuos líquidos (aceites de cocina). El aceite de cocina es el residuo más estudiado debido a que en su composición contiene ácidos grasos de cadena media y larga que pueden ser precursores de distintos tipos de PHA. Así por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa 42A2 ha sido utilizada para producir PHAs a partir de residuos de aceite de cocinas y otros restos lipídicos 7 Yan, S., Tyagi, R. D., & Surampalli, R. Y. (2006). Polyhydroxyalkanoates (PHA) production using wastewater as carbon source and activated sludge as microorganisms. Water Science and Technology, 53(6), 175-180. 8 Chaleomrum, N., Chookietwattana, K., & Dararat, S. (2014). Production of PHA from cassava starch wastewater in sequencing batch reactor treatment system. APCBEE procedia, 8, 167-172. 9 Vasudevan PT, Briggs M (2008) Biodiesel production - current state of the art and challenges. J Ind Microbiol Biotechnol 35:421- 430. 10 Ashby, R. D., Solaiman, D. K., & Foglia, T. A. (2005). Synthesis of short-/medium-chain-length poly (hydroxyalkanoate) blends by mixed culture fermentation of glycerol. Biomacromolecules, 6(4), 2106-2112. 11 Ashby R, Solaiman D, Foglia T (2002) Poly(ethylene glycol)-me diated molar mass control of shortchain- and medium-chain-length poly(hydroxyalkanoates) from Pseudomonas oleovorans. Appl Microbiol Biotechnol 60:154-159.

36. 25 Oliart-Ros, R. M., Manresa-Presas, Á., & Sánchez-Otero, M. G. (2016). Utilización de microorganismos de ambientes extremos y sus productos en el desarrollo biotecnológico. CienciaUAT, 11(1), 79-90. 5. Eficiencia del proceso downstream (extracción y purificación), pues la recuperación de PHAs se puede conseguir por choque osmótico con agua dulce. 1.4.1. Microorganismos extremófilos El descubrimiento de microorganismos extremófilos, capaces de vivir bajo condiciones extremas (temperatura, pH, salinidad, presión, radiación) diferentes a las que viven la mayoría de las formas de vida en la Tierra, ha despertado el interés de su estudio desde el punto biotecnoló gico, proporcionado herramientas de gran valor para su aplicación en una amplia gama de procesos biotecnológicos y aplicaciones industriales 25 . Existe gran variedad de microorganismos extremófilos, la mayoría de ellos son bacterias y arqueas, que se pueden clasificar según: 1. Temperatura a la que experimentan su crecimiento: - Termófilos: microorganismos que crecen en temperaturas entre 60 y 80oC. - Hipertermófilos: Su temperatura óptima de crecimiento está por encima de los 80 ° C y el máximo crecimiento de cultivos puros se ha llegado a dar entre 110 y 113 ° C. - Psicrófilos: Capaces de crecer por debajo de 5 ° C y con temperaturas máximas de 20 ° C. 2. Resistencia al pH - Acidófilos: viven a pH igual o menor que 3. - Alcalófilos: viven a pH igual o mayor que 9. 3. Salinidad del medio de crecimiento - Halófilos moderados: requiere entre 10 y 20% NaCl para vivir. - Halófilos extremos: pueden crecer en concentraciones superiores a 20% de sal. 4. Resistencia a la presión: Piezófilos o barófilos: microorganismos que requieres condiciones de alta presión (superior a 1 atm) para su desarrollo. 5. Metalófilos: microorganismos que pueden crecer en la presencia de altas concentraciones de metales se llaman metalófilos. 6. Radiófilos: resisten altos niveles de radiación. Es bastante común que un mismo organismo extremófilo pueda ser clasificado en varias categorías. Por ejemplo, los organismos que viven en zonas calientes, volcánicas bajo la superficie de la Tierra suelen ser termófilos y barófilos, pues soportan condiciones extremas tanto de temperatura como de presión como es el caso de Thermococcus barophilus. Aquellos que viven en zonas desérticas son xerófilos radiorresistentes, psicrófilos y oligotróficos y con frecuencia también toleran bien niveles de pH altos y bajos. La mayoría de microorganismos extremófilos, bacterias y arqueas, son anaerobios facultativos. Modalidad 1 Proyecto I+D independiente Fondo Europeo de Desarrollo Regional Una manera de hacer Europa 35 BIOPLASMUR - Memoria de ejecución

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