Proyecto: Encapsulación de compuestos sensibles a la temperatura para aditivación de polímeros biodegradables

 Introducción 


Los aceites esenciales (EOs) son líquidos aceitosos aromáticos y volátiles obtenidos de plantas. Normalmente se forman en células especiales o grupos de células, que se encuentran en hojas y tallos, y comúnmente se concentran en una región particular, como hojas, corteza o fruta.

Los EOs extraídos de plantas o especias son fuentes ricas de compuestos biológicamente activos tales como terpenoides y ácidos fenólicos.

Las actividades antibacterianas y antifúngicas de los EOs han sido reconocidas desde hace mucho tiempo, pero la industria alimentaria está ahora prestando más atención a su aplicación como antimicrobianos naturales.

Dentro de una gran variedad de EOs, el aceite esencial de orégano (OEO) extraído de Origanum vulgare L. está bien caracterizado por su actividad antioxidante y antimicrobiana.

Estas actividades se deben principalmente a los dos fenoles, carvacrol y timol (componentes principales del aceite esencial de orégano) y los hidrocarburos monoterpénicos p-cimeno y γ-terpineno que se presentan en menor concentración.

Sin embargo, al igual que otros EOs, el OEO es un compuesto volátil que se evapora y se descompone fácilmente durante el procesamiento a altas temperaturas o debido a la exposición directa al calor, presión, luz u oxígeno. Con el fin de superar la susceptibilidad y mejorar la estabilidad de los compuestos bioactivos durante el procesamiento y el almacenamiento, la tecnología emergente de la nanoencapsulación se ha aplicado recientemente en las industrias plásticas. La nanoencapsulación de compuestos bioactivos representa un enfoque viable y eficiente para la estabilidad física de las sustancias activas, protegerlos de las altas temperaturas durante los procesos de transformación de los plásticos. En otras palabras, la encapsulación puede reducir la pérdida de actividad de los compuestos activos. En el caso de los antimicrobianos, la encapsulación a nanoescala puede aumentar la concentración de los compuestos bioactivos en las áreas de los plásticos en contacto con alimentos, dando lugar a actividad antibacteriana sobre las superficies en contacto entre ambos.

Actualmente, el quitosano está suscitando mucho interés en la encapsulación de compuestos bioactivos debido a su biocompatibilidad, baja toxicidad y biodegradabilidad. Entre la variedad de métodos desarrollados para preparar nanopartículas de quitosano, la técnica de gelificación iónica se está empezandoa desarrollar debido a que este proceso es no tóxico, sin disolventes orgánicos, conveniente y controlable. La técnica de gelificación iónica se basa en la interacción electrostática entre los grupos amino primarios cargados positivamente de quitosano y los grupos cargados negativamente de polianión, como el tripolifosfato de sodio (TPP). La encapsulación de compuestos bioactivos derivados de aceites esenciales tales como carvacrol en partículas de quitosano- tripolifosfato podría prolongar su vida útil y conservar sus propiedades funcionales.

La presente investigación se enfocó así en la fabricación y caracterización de nanopartículas de quitosano-TPP cargadas con OEO por un proceso de dos pasos: emulsificación de aceite en agua y gelificación iónica.



 Estudio 


Preparación de partículas de quitosano cargadas con OEO

Las nanopartículas de quitosano cargadas con OEO se prepararon de acuerdo con un método modificado a partir de los descritos por Calvo et ál1. En resumen, se produjeron soluciones acuosas y de fase oleosa. Se preparó solución de quitosano (1% (m/v)) mediante agitación de quitosano en una solución acuosa de ácido acético (1% (v/v)) a temperatura ambiente (23-25ºC) durante la noche. La mezcla se centrifugó durante 30 min a 9000 rpm; El sobrenadante se retiró y se filtró a través de filtros de tamaño de poro de 1 μm. Se añadió Tween 80 (HLB 15,9, 0,45 g) como un tensioactivo a la solución (40 ml) y se agitó a 45ºC durante 2 h para obtener una mezcla homogénea. OEO (0,04, 0,08, 0,16 y 0,32 g) se disolvieron por separado en CH2C2l (4 ml) y después esta fase de aceite se dejó caer gradualmente en la solución acuosa de quitosano (40 ml) durante la homogeneización a una velocidad de 13.000 rpm durante 10 min manteniéndolo en un baño de hielo para obtener una emulsión de aceite en agua. Se añadió gota a gota una solución de TPP (0,4% (m/v), 40 ml) a la emulsión agitada. La agitación se realizó continuamente durante 40 min. Las partículas formadas se recogieron por centrifugación a 9000 x g durante 30 minutos a 4ºC, y posteriormente se lavaron varias veces con agua desionizada. Finalmente, se realizó la ultrasonicación dando como resultado una suspensión homogénea. Las suspensiones se congelaron inmediatamente a -35ºC durante 72 h. Las nanopartículas de quitosano y el sobrenadante se almacenaron a 4ºC.


Tamaño y morfología de las nanopartículas

La morfología de las nanopartículas liofilizadas se estudió mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Las nanopartículas secas congeladas (1 mg) se dispersaron en agua desionizada (20 ml) y se sonicaron durante 4 min. Una gota de la dispersión conteniendo nanopartículas de quitosano se colocó sobre una placa de vidrio y se secó a temperatura ambiente. Las nanopartículas secas se recubrieron entonces con oro a bajo alto vacío para su posterior estudio.

Se utilizó un microscopio de fuerza atómica para la caracterización morfológica y el tamaño de las partículas y la distribución de tamaño de las nanopartículas de quitosano y OEO cargadas de nanopartículas de quitosano.


Análisis instrumentales

Se realizó un análisis FTIR de quitosano puro, OEO puro y las nanopartículas de quitosano (cargadas o descargadas con OEO) y se realizó un barrido entre 400 y 4000 cm-1 con un espectrómetro Bruker.

El análisis de TGA se realizó con un analizador termogravimétrico Metter-Toledo.

Se registraron los patrones XRD sobre 2θ y un rango de 5-50º usando un difractómetro de rayos X con un ángulo de paso de 0.04º/min.



 

 Interpretación de los resultados 


Forma y tamaño de las nanopartículas de quitosano cargadas con OEO

La morfología de las partículas se observó mediante SEM. Las imágenes SEM de las nanopartículas de quitosano y las nanopartículas de quitosano cargadas con OEO demuestran distribución regular y forma esférica que parecen estar bien separadas y estables sobre las etapas del proceso de preparación (Figura 1).

1    Csaba, N., Köping-Höggård, M., & Alonso, M. J. (2009). Ionically crosslinked chitosan/tripolyphosphate nanoparticles for oligonucleotide and plasmid DNA delivery. International Journal of Pharmaceutics, 382, 205–214.


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Figura 1: Partículas de OEO-quitosano preparadas

La distribución de tamaños obtenida por AFM (Figura 2) indicó que la mayoría de nanopartículas de quitosano cargadas con OEO se distribuyeron entre los rangos de 40 y 80 nm.

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Figura 2: AFM (3D) imagen de las nanopartículas de OEO-quitosano

Las partículas de quitosano cargadas con OEO mostraron un diámetro medio en el intervalo de 309,8 - 402,2 nm.


Caracterización FTIR

La Figura 3 muestra los espectros FTIR del polvo de quitosano, nanopartículas de quitosano, OEO y nanopartículas de quitosano cargadas con OEO.    

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Figura 3: FTIR de (a) polvo de quitosano, (b) nanopartículas de quitosano, (c) OEO y (d) nanopartículas de quitosano cargadas con OEO

El chitosano mostró picos característicos a 3433 ( stretching OH y NH2), 2920 (stretching CH), 1647 (amida I), 1088 (stretching COC) y 591 cm-1 (stretching y vibration anillo piranósido) (Figura 3 (a)). Para las nanopartıculas de quitosano (Figura 3 (b)), el pico de amida I (flexión de NH2) cambió de 1647 a 1651 cm-1, y aparecieron nuevos picos a 1238 (extensión COC) y 1555 cm-1 (amida II). Los espectros de OEO puro muestran picos característicos acentuados a 2959 (stretching CH), 1589 (bending NH), 1458 (bending CH2), 1253 (stretching COC), 1117 (stretching COC) y 937 cm-1 (bending CH) (Fig 3c). Todos los picos característicos anteriores aparecen en los espectros de nanopartículas de quitosano cargadas con OEO en el mismo número de onda lo que indica que no hay modificación o interacción entre las nanopartículas OEO y quitosano (Figura 3 (d)).


Propiedades térmicas

El análisis termogravimétrico (TGA) es una técnica útil para estudiar el cambio de peso de una muestra en función de la temperatura y para evaluar la estabilidad térmica de una muestra. Como se muestra en los termogramas,el OEO posee sólo una etapa de pérdida de peso (Fig. 4(a)), mientras que las nanopartículas de quitosano y las nanopartículas cargadas de OEO muestran dos (figura 4(b)) y tres etapas de pérdida de peso Fig. 4 (c - f)), respectivamente.

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Figura 4: TGA de (a) OEO, (b) nanopartículas de quitosano y (c) - (f) nanopartículas de quitosano cargadas con OEO preparadas usando diferentes relaciones de peso inicial entre quitosano y OEO: (c) 1: 0,1, (d) 1: 0,2 , (e) 1: 0,4, y (f) 1: 0,8

Ensayo cristalográfico

La estructura cristalográfica del polvo de quitosano, las nanopartículas de quitosano y las nanopartículas de quitosano cargadas con OEO se determinaron por XRD y se presentan en la Figura 5. El quitosano exhibe un pico característico a 2θ de 25 º (Figura 5 (a)), indicando un altogrado  de  cristalinidad.  No  se  encuentran  picos  en  los  difractogramas  de  nanopartículas  de quitosano, lo que refleja la destrucción de la estructura de empaquetamiento de quitosano nativo.



 Conclusiones 


Las nanopartıculas de quitosano cargadas con OEO se prepararon satisfactoriamente mediante un método de dos etapas, es decir, la formación de una emulsión de aceite en agua y la gelificación iónica de gotitas de emulsión, como confirmaron las técnicas analıticas instrumentales (FTIR, TGA y XRD).

Las partículas son de forma esférica con un intervalo de tamaños entre 40 y 80 nm.

En futuros estudios, sería útil examinar el rendimiento de las nanopartículas basadas en quitosano para la encapsulación de otros aceites esenciales por este método en dos etapas.

En etapas posteriores de este trabajo se evaluará la incorporación de estos materiales en matrices poliméricas.

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Figura 5: Patrones XRD de (a) polvo de quitosano, (b) nanopartículas de quitosano y (c) nanopartículas de quitosano cargadas con OEO

Para descargar el documento técnico completo acceda por el enlace:

https://drive.google.com/open?id=1EvOF5jf_agEDjg6451H0kWCpCPmfEuHL

 

Odoo - Prueba 1 a tres columnas


Odoo - Prueba 2 a tres columnas


Odoo - Prueba 3 a tres columnas